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    如何做好细胞的培养、传代、冻存和复苏?

    发布时间: 2021-12-07  点击次数: 294次

    1.准备工作:

    根据培养细胞的特性,提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件,以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时,充分了解到细胞的生长特性和形态特征,便于后续的培养观察。


    2.贴壁细胞传代:

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    1)移弃使用过的细胞培养液。(不要直接倒掉,避免瓶口残留导致易污染)

    2)使用不含钙镁离子的平衡盐溶液(PBS)冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液,以避免搅动细胞层,前后摇晃容器数次,最后移弃冲洗液。(洗去残留的血清,避免影响胰酶的活性。)

    3)以 25 cm2的培养瓶为例,向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA(请根据各细胞的指引使用合适的浓度)消化液,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面,放到37 ℃ 孵育。通常,几分钟内,会发现胞质回缩、细胞间隙增大,倾斜培养瓶时细胞层能自然流下,此时应加入2-3ml含血清的完全培养液终止消化(细胞解离所需时间请参考各细胞的指引,并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况)。另外,并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离,请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。

    4)使培养瓶倾斜,吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面,重复该动作2-3次,使所有细胞沿瓶底流下,再轻柔地把细胞吹打成单个悬液(吹打过程中应避免气泡的产生)。

    PS:对于难消化的细胞,尽量不要通过用力吹打的方式来处理,以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来,及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化,避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。

    5)把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中,800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。

    6)加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,补足新的含血清完全培养液,轻轻摇晃混匀。

    7)放到37 ℃ 孵育,第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。

     

    3.悬浮细胞传代:

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    因悬浮生长细胞不贴壁,故传代时不必采用酶消化方法,而可直接传代或离心收集细胞后传代。

    1)直接传代时,静置5-10分钟,待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后,吸掉1/2-2/3原培养液,补足新鲜的含血清完全培养液,混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,轻轻摇晃混匀。

    2)离心传代时,将细胞连同培养液一并转移到离心管内,800-1000rpm离心3-5分钟,移弃上清后,加入新鲜的含血清完全培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例,把细胞悬液均匀分到各培养器皿中,补足新鲜的含血清完全培养液,轻轻摇晃混匀。

    3)放到37 ℃ 孵育,第二天显微镜下观察细胞的情况。

     

    4.贴壁悬浮混合型细胞传代:

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    先将悬浮的细胞收集,再参考“贴壁细胞传代"方法进行消化收集,一起接种到培养器皿中。

    PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高,培养中最好参考指南控制好细胞密度,不能过密也不能过稀。

     

    5.细胞冻存:

    1)按照“细胞传代步骤"中的方法收集细胞。

    2)加入细胞冻存液(一般10%DMSO+对应细胞的完全培养液),使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml,移入细胞冻存管中。

    3)程序降温(以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例):4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。(一定不能省略4℃的30min,否则冻存液无法渗透到细胞,易产生冰晶导致细胞受损。)

     

    6.细胞复苏:

    1)取出贮存的细胞,待液氮挥发后,马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化(通常2min内,时间长了细胞状态会受影响)。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂,操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。

    PS:干冰运输的冻存细胞,收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中,至少3d后再进行复苏操作。

    2)转移到无菌操作台,75%酒精擦拭冻存管外部。

    3)将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清完全培养液离心管中,800-1000rpm离心3-5分钟,移弃上清。

    4)重新加入经预热的含血清完全培养液重悬细胞,以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。

    5)放到37℃孵育,第二天显微镜下观察细胞的情况。


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