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    如何做好细胞的污染防治?

    发布时间: 2021-12-07  点击次数: 238次

    细胞培养,受人员操作和环境条件的影响比较大,在细胞培养中常常会遇到很多的细节问题,而每个问题都有可能导致细胞培养的失败。所以做好细胞的污染防治是能否顺利开展细胞实验的必要措施。

    1.细菌污染

    细菌污染是细胞培养中最常见的污染,主要由操作不慎或使用了灭菌不完全的耗材与试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。

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    左边的就是比较典型的杆菌污染,一般杆菌会延轴向快速游动,量少时培养基澄清。右图是颗粒状污染,一般培养基会浑浊或有白色沙状沉淀。

     

    好氧菌增殖分裂迅速,感染24h内即可使培养基浑浊;厌氧菌在常规细胞培养条件下增殖缓慢,需要较长时间才会观察到浑浊现象。

     

    污染处理:由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥,所以出现污染后加双抗(青霉素&链霉素,Penicillin + Streptomycin)一般没有效果。杆菌可选用100ug/ml庆大霉素处理一周,颗粒状细菌可用25ug/ml环丙沙星处理一周,效果相对还不错。

     

    2. 真菌污染

    细胞培养中最常见的污染真菌有:烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

    左边这张是比较典型的霉菌污染的图片,右图是酵母污染,镜下可以看到明显的出芽形态。

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    污染处理:可用100ug两性霉素B/T25瓶,处理一周。

    注:两性霉素毒性较大,需要在细胞有50%以上且状态没受大影响前处理。

     

    3.支原体污染

    支原体的危害:支原体污染可以改变细胞的特性。例如部分支原体会快速消耗培养液中的精氨酸,与细胞竞争营养,从而使细胞的生长速度减慢或停止;同时支原体还可以改变细胞的酶谱、细胞膜成分,造成细胞染色体异常或细胞病理性改变等。上述情况会严重影响到使用这些细胞所做实验的结果,导致结论不可靠。

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    (PCR法检测细胞上清中的支原体污染)

    支原体的预防与清除:由于支原体无法在镜下直接看到,需要通过PCR法等进行检测才发现,出现污染后比较难发现。建议在养细胞每月检测一次并结合每周抽检,做到有污染早发现。对于正在进行支原体去除处理的细胞建议每周必检,直至出现阴性结果并至少维持一月。不同的细胞分开处理,优先处理“支原体阴性"细胞,后处理正在做去除处理的和受感染的细胞。同时,新引进的细胞系都进行支原体检测,确保不给实验室带来新的污染。

     

    4.实验室细胞污染防治

    建立良好的规章制度对减少细胞污染会有很大的帮助。包括准入制度、操作规范和日常管理制度。

    准入制度:包括了人员的和物料的。人员需要进行培训之后才能自己进行操作,而且要符合穿戴要求才能进实验室,如白大褂、隔离服,口罩,手套等。而所需用到的物品,非一次性的物品应严格消毒灭菌,而购买的物品需要从正规的、可靠的渠道购买。新买的细胞应检测验证后再使用。

     

    操作规范:对于常规操作最好制定规范,且实验室人员都要按操作规范进行,不能随意更改,同时也是培养实验人员的良好操作习惯。比如,枪头滴管吸完就不再二次伸入培养基中吸取,一次吸够足够量的培养基。加液时也应尽量做到悬空加液,这些都可有效预防支原体污染和细胞交叉污染。另外可以的话,一次只操作一株细胞,细胞与细胞间最好有一点时间间隔,避免交叉污染。

     

    日常管理制度:则包括环境及耗材试剂等的使用、清洁、保养等各方面的规则、方法。还有试剂耗材等的用量、库存及采购等的管理,包括细胞样品的两级库存管理。对于不易发现的污染源,最好定期进行检测,主要是支原体污染和细胞交叉污染。


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