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    哺乳动物细胞基因稳定转染的实验

    发布时间: 2021-12-14  点击次数: 123次

    材料与仪器


    哺乳动物细胞
    完全培养液
    培养箱 离心管


    步骤


    1.  确定所要转染的细胞系能呈独立集落生长。对于贴壁细胞,在10 cm 组织培养培养皿中接种约100个细胞,培养10~12天,毎4天换液1次。亚甲蓝染色后对成活的细胞集落进行计数。

     
    2.  确定母代细胞的选择条件:将一培养皿上生长汇片的细胞按不小于1:15的比例分传于含有不同药物浓度的培养液中。培养10天。用合适的选择培养液每4天换液1次, 并检查活细胞。
     
    3.  确定转染母代细胞的最有效的方法。可选用磷酸钙或电穿孔方法。对于磷酸钙转染,在加DNA的前1天,将母代细胞按1:15分传中完全培养液中。
     
    4.  用目的基因转染母代细胞,含目的基因的质粒与含标记基因的质粒的摩尔比例不小于5:1。用担体DNA替代含有目的基因的质粒作为对照,分别进行几次转染。
     
    5.  在无选择条件下让细胞倍增2次。将细胞按1:15分传于选择培养液中。
     
    6.  在选择培养液中接种5个以上培养皿,以得到尽可能多的能挑取和扩增成细胞系的细胞集落数,每4天用选择培养液换液,培养10~12天,将培养皿对着光成一角度观察其中的细胞克隆,其中的一只培养皿直可进行染色以便于计算细胞集落数。挑取大的、生长良好的细胞集落。


    注意事项


    如果用5:1的比例,没有必要在转染前将透择标记基因与目的基因连接起来:如果选择需要用大量的选择性质粒,有时无态保证5:1比例,故要将选择标记基因及所要研究的目的基因构建在同一个质粒中。如果用含有所研究的基因进行转染没有形成克隆,而在含有的对照中却可产生究隆,则所研究的基因能有细胞毒性。


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    安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户,提供独特细胞体内可代谢的核酸转染试剂;inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产,包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等,为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务;提供以植物生物为平台基因序列全人源化、独特的细胞培养可分解3D基质胶产品;提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务,努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。


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