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    变性凝胶电泳实验

    发布时间: 2021-12-14  点击次数: 245次

    材料与仪器


    DNA
    乙醇 异丙醇 二甲基二氯硅烷 TEMED 变性丙烯酰胺溶液 SDS
    电泳仪 注射器 巴斯德吸管 干胶机


    步骤


    1.  制作每块凝胶时,首先要用肥皂及水小心严格地清洗两块30 cm×40 cm的前后玻璃平板,用去离子水冲洗后晾干,用喷射洗瓶喷10%乙酵或异丙醇使平板湿海。

    2.  然后用Kimwipe纸或其他无绒纸巾将平板擦干。

    3.  戴手套在通风橱工作,用浸湿了含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe纸在每片平板的其中一面加一层此溶液,并小心洗擦拭整面平板。

    4.  待硅化层干后,用Kimwipe纸以70%乙醇或异丙醇擦净并干燥,最后再检查平板有没有灰尘或其他物质。

     
    5.  按厂商指南用0.2~0.4 mm 均厚的垫片和大的书本装订夹子组装凝胶胶模夹层,注意垫片与平板的边、底压紧对齐。

    6.  制作每块凝胶时,在100 ml 烧杯配制60 ml 所需的变性丙烯酰胺凝胶溶液,在灌胶(步骤7)前,彻底混匀60 μl TEMED和0.6 ml 10%过硫酸铵于每份丙烯酰胺溶液中。
     
    7.  立即灌胶,用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液,避免吸入气泡,让短平板朝上, 并使凝胶平板夹层与臬面成45度角,沿着平板的一边慢慢将丙烯酰胺溶液推入两片平板之间,其间可调整角度让胶液慢馒流入夹层的一边。

    8.  当溶液达到短平板的顶部时,放下胶模夹层至其顶部边缘离操作台平面仍有5 cm 左右,其下垫一空的吸头盒或其他物件以使之保持较低的角度。

    9.  将0.2~0.4 mm 厚的鲨鱼齿样品梳的平齐一侧插入胶液中,至短平板下约2~3 mm,操作须十分小心以避免产生气泡,用一个书本装订夹将平极之间的样品梳夹紧,以避免在掩子与平板间形 成凝胶固块。

    10.  加一层过量的丙烯酰胺溶液至梳子,保证其被完全覆盖。用水冲洗注射器,除去过量的丙烯酰胺。

    11.  除去每片胶模夹层的底部垫片或胶带,用刀片除去样品瓶周围的过量聚丙烯酰胺凝胶。

    12.  用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液,从每片胶模夹层中拨去鲨鱼齿样品梳,避免拉伤凝胶顶部。

    13.  用水清洗梳子,准备好在步骤16操作时重新插回样品孔。如果用常规样品梳,小心防止撕裂聚丙烯酰胺加样孔,
     
    14.  凝胶电泳装置的下层贮液槽加入1XTBE缓冲液,使凝胶夹层能浸泡在2~3 cm 的一层缓冲液中,放入凝胶夹层并用夹子固定在电泳装置上。

    15.  上层贮槽倒入1×TBE缓冲液,使超过凝胶顶部约3 cm,用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE清洗凝胶顶部。
     
    16.  将清洗干净的鲨鱼齿样品梳重新播回凝胶夹层,使其齿部仅可触及凝胶,用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE缓冲液彻底清洗加样孔,以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。
     
    17.  加样前,在45 V/cm 凝胶的电压降下预电泳,使凝胶预热,即在1 700 V,70 W 恒功率下电泳约30 min。

    18.  在加样前,清洗加样孔除去浸进孔中的尿素。
     
    19.  在甲酰胺/染料溶液中的样品,盖好盖子,在95℃加热2 min,然后置于冰上,每孔加 样2~3 μl 测序用的加样吸头可于每次加样后在下槽缓冲液中冲洗2次后继续使用。

    20.  在45~70 W 恒功率下电泳,凝胶温度保持在约65℃。

    21.  高于此温度可能会造成玻璃平板炸裂或条带弥散,而太低温度可使测序产物不完全变性、现察标志染料的迁移以确定电泳时间。

    22.  将干冰加入干胶机的冷阱并预热至80℃。

    23.  电泳完毕时,排出上下液槽的缓冲液,并按放射性废物处理丢弃液体。

    24.  从电泳装置中取出凝胶夹层,并在冷自来水下冲洗直至两面玻璃平板表面都冷却为止,将夹层平放在纸巾上,四口玻璃平板(短平板)朝上,除去多余的液体及夹子、胶带,取出一边的垫片。

    25.  两片玻璃平板之间插入一个长金属铲子,轻轻转动铲于将玻璃 平板橇起使之分开,凝胶应贴在下面的玻璃平板,如果贴在上面的平板,则将它翻转过来。

    26.  从插有铲子的一边馒慢提起上面的平板,遂渐增加角度直至上层平板完全与凝胶分离。
     
    27.  一旦平板分离后,取去另一边的垫片及除去凝胶周围多余的聚丙烯酰胺碎片。
     
    28.  如果样品含32P或33P,固定步骤可用可不用。如果样品含33S,直接将凝胶连同玻璃平板一起放入浅托盘中,轻轻覆盖一层约2 cm 的5%乙酸 / 5%甲醇固定液,浸泡10~15 min,不时轻轻摇动托盘使凝胶与玻璃平板松开。
     
    29.  将疑胶重新置于平板上,靠吸力或重力除去固定液注意保持凝胶处于平极的中央, 小心从托盘中将平板连同凝胶取出,放在工作平台上。

    30.  将两张干的转印纸,叠齐如 同一张一祥,从凝胶的一端开始缓慢地向另一端放下,贴在凝胶的表面,小心防止在纸和凝胶间形成气泡。

    31.  从平板上剥起转印纸,凝胶应和它一起被揭起,逐渐卷起纸,而凝胶就同它一起被剥离平板。

    32.  将滤纸和凝胶放在预热的干胶机中,上面覆盖一张保鲜瞑,80℃处理20 min ~1 h,使凝胶彻底干燥。
     
    33.  从干胶上揭去保鲜膜,将干胶放在X光曝光盒中,Kodak XAR-5X光胶片直接与凝胶接触,室温放射自显影,经足够时间曝光后(一般需过夜)取出X光胶片并冲印。


    常见问题

    变性聚丙烯酰胺凝胶中相对于示踪染料的寡核苷酸的迁移

    变性聚丙烯酰胺凝胶中相对于示踪染料的寡核苷酸的迁移


    同实验其他方法

    电解质梯度测序胶

    1.  按基本方案步骤1~22灌制凝胶及进行预电泳,但上槽缓冲液为0.5×TBE,下槽为1×TBE。 2.  按基本方案步骤23~26步准备样品及加样。   3.

    含甲酰胺的测序胶

    1.  按基本方案步骤1~5组装凝胶平板夹层。   2.  按所需浓度配制甲酰胺凝胶溶液,加热轻轻挽拌使之溶解,冷却至30℃以下。 3.  加入0.15 ml TEMED

    缓冲液梯度测序胶

    1.  按基本方案步骤1~5组装凝胶平板夹层。   2.  在2个100 ml 烧杯中,配制缓冲液梯度凝胶溶液:50 ml 用0.5×TBE配制,25 ml 用2.5×TBE配制

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