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    从大规模裂解物中制备λ噬菌体颗粒实验

    发布时间: 2021-12-20  点击次数: 163次

    原理

    从大规模培养物中制备的 λ 噬菌体,可在高盐存在下用聚乙二酵 ( PEG ) 沉淀的办法从裂解物中回收得到。残余的细胞碎片和 PEG 可用氯仿抽提。在进一步纯化之前,建议测定噬菌体制备物的得率。

    材料与仪器

    大肠杆菌培养物
    氯仿 NaCl 聚乙二醇 SM 胰 DNaseⅠ
    Sorvall GSA 转子或相当型号 量筒

    步骤

    一、材料

    1. 缓冲液和溶液

    氯仿,NaCl ( 固体),聚乙二醇(PEG 8000)(每 500 ml 培养物大约用 50 g),SM。

    2. 酶和缓冲液

      胰 DNase Ⅰ ( 1 mg/ml),胰 RNase ( 1 mg/ml ) 于 TE 中(pH 7.6 )。

    3. 离心机和转子

    Sorvall GSA 转子或相当型号。

    4. 专用设备

    量筒(2 L)。

    5. 载体和菌株

    大肠杆菌培养物,经 λ 噬菌体感染和裂解。

    二、方法

    用 PEG 沉淀噬菌体颗粒

    1. 将含有 λ 噬菌体的裂解培养物冷却至室温,加胰 DNase Ⅰ 和 RNase 至终浓度均为 1 μg/ml,室温温育 30 min。

    2. 每 500 ml 培养物加入 29.2 g 固体 NaCl(终浓度为 1 mol/L),搅拌使其溶解。将培养物冰浴 1 h。

    再用 PEG 沉淀噬菌体颗粒中,NaCl 的加入促进了噬菌体颗粒与细胞碎片之间的分离,因此是有效沉淀所需的。一些研究人员喜欢在加入 PEG 的同时加入 NaCl,那样的话步骤 3 的离心过程可被省略。但需要告知的是,只有当噬菌体生长良好且其在最初裂解培养物中的滴度大于 2X1010 pfu/mI 时,PEG 和 NaCl 的同时加入才能有效地沉淀噬菌体颗粒。

    3. 4℃,11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 转子中)离心 10 min 以去除细胞碎片,将四份培养物的上清混合置于 2 L 的干净量筒中。

    4. 测定所收集上清的总体积,然后转移至 2 L 的烧瓶中,加固体 PEG 至终浓度为 10% (m/V,如 500 ml 上清加 50 g PEG),于室温用磁力搅拌器慢慢搅拌溶解 PEG。

    5. 将噬菌体/PEG 溶液转移至聚丙烯离心管中,于冰水浴冷却,至少放置 1 h 以便使噬菌体颗粒发生沉淀。

    6. 4℃,11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 转子中)离心 10 min 以回收沉淀的噬菌体,去上清,将离心管倒过来倾斜放置 5 min,以便使剩余液体充分流干。用移液器吸去残余的液体。

    用氯仿抽提细菌碎片

    7. 用一带橡皮球的宽口吸管将噬菌体沉淀轻轻地重悬于 SM 中(针对步骤 3 每 500 ml 上清加 8 ml SM),将离心管倾斜放置,使 SM 完全覆盖并浸泡噬菌体沉淀,室温放置 1 h。

    彻底但温和地冲洗整个离心管壁,因为噬菌体沉淀会黏附在管壁上,尤其当离心管比较陈旧有凹痕时。而如果剧烈地吸取噬菌体,容易造成其尾部的断裂。

    8. 通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬浮液中的 PEG 和细胞碎片,温和振荡 30 s。4℃,3000 g(4300 r/min 于 Sorvall GSA 转子中)离心 15 min 以分离有机相和亲水相,回收含噬菌体颗粒的亲水相。

    为了测定得率,用凝胶电泳分析噬菌体悬浮液。

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