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    CPB沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸实验

    发布时间: 2021-12-20  点击次数: 310次

    材料与仪器

    十六烷基溴化吡啶 EDTA-Tris EDTA-Tris-DNA 溶液 乙醇-乙酸钠溶液 乙醇 乙酸钠 TE(pH7.6) 或适当的预杂交液 核酸和寡核苷酸 纯化的原料
    干冰 乙醇浴

    步骤

    材料

    溶液和缓冲液
    稀释贮存液至适当浓度。

    十六烷基溴化吡啶(CPB)1%,m/V)
    将 1 gCPBW(sigma 公司)溶于 100 ml 水中,加热并用磁力搅拌器搅拌溶液可加速溶解。待去污剂全部溶解后,将溶液冷却至室溫,用硝酸纤维素滤膜过滤(0.45um 孔径)

    EDTA-Tris(0.5mol/L,pH6.0)
    用 60 ml 水溶解 0.1mol EDTA, 在搅拌溶液的同时, 加入 Tris 碱(粉末),直到溶液 pH 值达到 6.0, 此时 Tris 的浓度为约 1.2mol/L。加水使溶液的体积为 200 mL。这不同于常规配制方法,但对于阳离子去污剂有效地沉淀核酸是非常必要的(Sibatani1970)。

    EDTA-Tris-DNA 溶液
    用 50 mmol/LEDTA-Tris(pH6.0)(1:10 稀释 0.5mol/LEDTA-Tris 溶液)溶解载体 DNA(鮭精DNA), 使其浓度为 50ug/ml 载体 DNA 应大小均一、不干扰放射性标记核酸与靶 DNA 的杂交。用超声处理或鲑精 DNA 片段可满足多数实验的要求(超声处理鲑精 DNA 的长度在 600~5000bp,可以从 Pharmacia 公司购得或按第 6 章的方案 10 制备)。

    乙醇-乙酸钠溶液

    80%(V/V) 乙醇

    20%(V/V) 乙酸钠(0.1mol/L,pH5.2)

    TE(pH7.6) 或适当的预杂交液
    见步骤 8。

    核酸和寡核苷酸

    放射性标记的寡核苷酸

    纯化的原料是方案 2(步骤 3 或步骤 5) 的反应混合液,T4 噬菌体多核苷酸激酶已在 68°C 灭活。

    专用设备

    干冰/乙醇浴

    方法

    1. 含有放射性标记的寡核苷酸的微量离心管中加入 5~10 倍体积的 EDTA-Tris-DNA 溶液,充分混合。
    为进行有效的沉淀,务必使终末反应混合液中 EDTA-Tris-DNA 溶液的离子成分占优势,混合液的终体积与放射性标记寡核苷酸的浓度对本方法的效率不产生影响。

    2. 加入足量的 1%CPB, 使离心管中混合液的去污剂浓度达到 0.1%, 充分混匀。

    3. 将离心管置于干冰/乙醇浴中至混合液冻结。从冰浴中取出离心管,室温下使混合液融化。

    4.4°C 下以最大转速离心 5 min, 用巴斯德吸管或装有一次性蓝吸头的微量移液器小心吸去管中的上清。
    警惕:上淸中含大部分未掺入的 [γ-32P]ATP。磷酸化反应常使用大于100uCi 的放射性标记 ATP,因此上清中放射性剂量相当可观,应小心谨慎处理未掺入的放射性物质、移液器吸头及离心管。

    5. 在管中加入 500ul 蒸馏水,振荡 20s, 再次按步骤 4 离心。

    6. 吸去管中上清,加入 500ul 乙醇-乙酸钠溶液,振荡 15s,随后在室温下以最大转速离心 2 min。

    7. 重复步骤 6。

    8. 小心吸去上清。打开离心管盖,放置在试验台聚异丁烯酸树脂有机玻璃防护屏后,直到剩余可见的乙醇挥发干净。用 20~50ulTE(pH7.6) 溶解沉淀的寡核苷酸。如放射性标记的寡核苷酸用作探针,则用小体积预杂交液溶解。

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