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    纯化的RNA的点杂交和狭线杂交

    发布时间: 2021-12-21  点击次数: 282次

    原理

    点杂交和狭线杂交技术(Kafatos et al. 1979) 用于在同一固相支持物(通常为带电荷的尼龙膜)上固定几种核酸样品,然后用合适的探针与已固定的样品杂交,并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出 的信号的强度,与已知浓度的标准品信号强度 进行比较,确定待测样品中靶序列的量。

    材料与仪器

    RNA 检测样品、标准品和阴性对照 探针标记与变性
    NaOH 预杂交液 RNA 变性液 SSC
    印迹装置 绞链仪 带正电荷尼龙膜 厚印透纸 水浴锅

    步骤

    一、材料

    1. 缓冲液与溶液

    NaOH ( 10 mol/L)

    预杂交液

    RNA 变性液

    0.1X SSC ( 含 0.1% SDS,m/V)

    0.1X SSC ( 含 1%SDS,m/V)

    0.5X SSC ( 含 0.1% SDS,m/V)

    1X SSC ( 含 0.1% SDS,m/V)

    2X SSC

    20X SSC

    2. 核酸与寡聚核甘酸

    RNA 检测样品、标准品和阴性对照

    3. 探针

    探针标记与变性

    4. 专用设备

    印迹装置

    绞链仪(如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-rad) 或真空炉、微波炉

    带正电荷尼龙膜

    厚印透纸(如 Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

    预热水浴锅到 68℃

    二、方法

    安装印迹装置

    1. 切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿,在 20X SSC 中室温泡 1 h。

    2. 在膜浸泡期间,先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印迹装置,再用无菌水洗干净。

    3. 把两片厚滤纸用 20X SSC 浸湿,再放到真空器顶部。

    4. 把样品槽插入装置的上部,把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部,用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。

    5. 加紧夹板,连接真空管。

    6. 加入 10X SSC 直至液面没过尼龙膜,关掉真空,再用 10X SSC 充满。

    RNA 样品准备

    7. 把每个 RNA 样品(溶解在 10 μl 水)分别与 30 μl RNA 变性液混合。

    8. 65℃ 温育 5 min,然后在冰上冷却。

    9. 向每个样品中加入等体积 20X SSC。

    10. 轻轻向印迹装置中吸入 10XSSC,直到淹没尼龙膜。

    RNA 样品的印迹和 RNA 在膜上的固定

    11. 把所有样品轻轻加入狭线中,然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后,每个狭线用 1 ml 10XSSC 洗两次。

    12. 当第二次洗膜完成后,继续轻轻吸干膜。

    13. 取下膜,然后用紫外交联、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。

    固定化 RNA 的杂交与洗膜

    14. 把膜放入烤盘或杂交炉中,加入 10~20 ml 预杂交液 68℃ 温育 2 h。

    15. 把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育 12~16 h。

    16. 杂交完后从塑料袋中取出膜,然后尽可能快地把膜转移到室温下装有 100~200 mJ、1X SSC ( 0.1% SDS) 的塑料容器中。盖紧塑料容器,放到摇床上轻摇 10 min。

    17. 把膜转移到另一个装有 100~200 ml 的、预热到 68℃ 的 0.5X SSC ( 含 0.1% SDS) 的塑料袋中,然后在此温度下轻摇 10 min。

    18. 按步骤 17 重复洗膜两次,使总的洗膜次数达到三次。

    19. 用滤纸吸干膜,在 -70℃ 条件下放射自显影 24~48 h ( Kodak XAR-5 或相当的胶片)。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然,磷光成像仪也可以用来成像。

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