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    从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA

    发布时间: 2021-12-20  点击次数: 151次

    原理

    这一简单的实验方案在成百上千的实验室被广泛应用于转基因或基因剔除小鼠的基因型鉴定以及从小量培养的细胞或组织块中提取 DNA。

    材料与仪器

    蛋白酶 K 培养的细胞 鼠尾或小鼠组织
    乙醇 异丙醇 酚 氯仿 异戊醇 磷酸盐缓冲溶液 SNET TE
    Sorvall 离心机及 H1000B、SH-3000 转头 聚丙烯管 振荡平台 振荡平台或振动孵箱 Shepherd 氏钩

    步骤

    一、材料

    1. 缓冲液及溶液

    乙醇

    异丙醇

    酚:氯仿:异戊醇(25:24:1 V/V)

    磷酸盐缓冲溶液

    SNET(20 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0),5 mmol/L EDTA ( pH 8.0),400 mmol/L NaCl,1% (m/V) SDS)

    TE ( pH 8.0)

    2. 酶及缓冲液

    蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

    Sorvall 离心机及 H1000B、SH-3000 转头(或其他相当的设备)

    3. 专用设备

    聚丙烯管(17 X 100 mm)

    室温及 4℃ 振荡平台

    预设为 55℃ 的振荡平台或振动孵箱

    Shepherd 氏钩

    4. 细胞和组织

    培养的细胞

    鼠尾或小鼠组织

    二、方法

    1. 准备适量的裂解缓冲液,即在 SNET 中加入蛋白酶 K 使终浓度为 400 μg/ml 向鼠尾或其他组织中加入裂解缓冲液。

    2. 管子垂直放置于振荡平台或振动恒温箱中 55℃ 放置过夜。

    消化过程中样品的充分混合是非常重要的。过夜消化后,应当看不到组织或鼠尾,缓冲液呈灰色乳状液。

    3. 加入等体积的酚: 氯仿: 异戊醇,密闭管口,室温下置于振荡平台 30 min。

    4. 离心分离有机相和水相。17X100 mm 的 Falcon 聚丙烯管中的样品室温下 666 g 离心 5 min, 即带有旋转桶的 Sorvall H1000B 转头 1800 r/min 或 Sorvall SH3000 旋转桶 1600 r/min。对于较小体积的样品,样品置于微量离心管中室温下用最大转速离心 5 min。转移上层水相至一新的 Falcon 管或微量离心管中。

    5. 加入等体积的异丙醇沉淀 DNA。4℃,13250 g 离心(8000 r/min,Sorvall 3000 转头或微量离心管中用最大转速)15 min 收集沉淀的 DNA。

    6. 小心除去异丙醇。将 DNA 沉淀浸于 1 ml 70% 的乙醇里。如果沉淀较松散,再离心 5 min。除去 70% 的乙醇,室温下空气中干燥沉淀约 15~20 min。

    不要让 DNA 沉淀彻底干操,否则极难溶解。

    7. 加入 0.5 ml TE, 4℃ 下轻柔振荡过夜使核酸沉淀溶解。

    8. 将溶液转移到微量离心管中,室温保存。

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