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    制备YAC DNA进行Southern印迹分析

    发布时间: 2021-12-24  点击次数: 153次

    材料与仪器

    酵母菌
    AHC SCE SCEM Tris·Cl EDTA TE 乙酸甲 RNase A 异丙醇 NaCl
    培养箱 离心管 转子

    步骤


    1.  接种一个红色的含YAC克隆的酵母菌落于盛有20 ml AHC培养基的250 ml 三角烧瓶中,在旋转摇床上30℃ 250 r/min 振荡培养24 h。
     
    2.  扩大培养:取1ml 由步骤1获得的粉红色菌悬液接种于盛有100 ml AHC培养基的 1 000 ml三角烧瓶中,于30℃ 250 r/min摇床培养24 h。

    3.  将菌悬液移入2个50 ml 的锥形离心管中,于2 000 g 离心5 min,弃上清,共用5 ml SCE缓冲液重悬菌体,并合并到一个试管中。

    4.  加1 ml SCEM缓冲液,在旋转摇床中37℃ 100 r/min 轻摇晃混匀。

    5.  于4℃ 2 000 g 离心弃上清,菌体用5 ml Tris/EDTA裂解液重悬。

    6.  加0.5 ml 10%SDS颠倒混合数次,于65℃温育20 min。
     
    7.  加2 ml 冰浴的5 mol/l pH4.8的乙酸甲缓冲液,颠倒混合数次后置于冰浴60 min。

    8.  于室温2 000 g 离心10 min,小心将含核酸的上清转移到一个新管中。加室温2倍体积的95%乙醇,颠倒混匀。

    9.  于室温2 000 g 离心5 min,弃上清,在室温晾干10~15 min,分别加入3 ml TE缓冲液,pH8.0于37℃过夜溶解核酸。

    10.  加入0.1 ml 的1 mg/ml 无DNA酶活性的RNase A,于37℃温育1 h。
     
    11.  加入6 ml 室温的异丙醇,振荡并颠倒混匀后用一支毛细管缠绕起染色体,然后溶于0.5 ml TE缓冲液中。

    12.  加入50 μl 5 mol/l NaCl和2 ml 95%乙醇,颠倒混匀。

    13.  再一次缠绕起染色体DNA,并溶于0.5 ml TE缓冲液中,于4℃保存备用。
     
    14.  取毎小份2 μg 的YAC DNA和15 μg 用以构建YAC文库的某物种或个体的基因组DNA。

    15.  采用几种高频切割的限制性内切酶进行酶切,接着用单拷贝探针进行杂交和核酸印迹分析。
     
    16.   一旦通过核酸印迹实验确证YAC克隆,那么可通过制备染色体凝胶校块塞和进行脉冲电场凝胶电泳,来明确重组YAC的大小并对其稳定性进行初步评价。


    同实验其他方法

    YAC 克隆的分析实验

    1.  用接种棒将含重组载体pYAC的AB1380菌株划线接种在AHC平板上,倒扣平板于30℃培养,直至长出1~3 mm 大小的红色菌落为止。 2.  短期保存:用Parafilm膜将平

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