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    氨基酸代谢标记实验

    发布时间: 2022-03-10  点击次数: 121次

    原理

    在含有放射性标记氨基酸的培养基中,短期培养细胞(<30min)对蛋白质进行脉冲标记。


    材料与仪器

    37℃ 细胞悬液 [35S]标记L-甲硫氨酸(>800 Ci/mmol)/[35S]标记蛋白质水解产物
    PBS(冷冻) 37℃ 脉冲标记培养基
    配有液体同位素垃圾阀门的真空吸气器


    步骤

    1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸,并用预热的(37℃)脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。


    2. 室温下 300 g 离心 5 min,获得悬液中 0.5 × 107~2 × 107 细胞。用 10 ml 预热的脉冲标记培养基洗细胞。室温下 300 g 离心 5 min, 吸弃上清。轻柔敲打试管底部使细胞重悬并再洗一次。


    3. 用预热脉冲标记的培养基重悬细胞,使其浓度为 5 × 106/ml。在 37℃ 水浴中温育 15 min 以去掉细胞内的甲硫氨酸。定时颠倒试管来使细胞重悬。


    4. 室温下 300 g 离心 5 min,吸弃上清。用 2 ml [35S] 标记甲硫氨酸的工作溶液(见步骤 1)重悬细胞,转移至干净 15 ml 离心管中。盖紧盖子。在 37℃ 水浴中温育 10~30 min, 不时轻柔颠倒试管或振荡使细胞重悬。


    5. 4℃、300 g 离心 5 min,吸弃上清。用 10 ml 冰预冷的 PBS 轻柔重悬并再次离心。


    6. 可选:通过三氯乙(yi)酸(TCA)沉淀来测定标记物的掺入量(见辅助方案)。


    7. 如果细胞沉淀不马上使用的话,可以置于冰上几小时或 80℃ 保存几天。分析前冰上融化细胞沉淀。


    注意事项

    1. 在标记过程中,挥发性的含有[35S]标记的化合物可能会释放,含有[35S]标记甲硫氨 酸的培养基应保存在密闭紧盖的试管中,用前置于37°C水浴。在37°C不能超过60 min。

    2. 在大多数情况下,冷冻细胞不会影响蛋白质的生物化学特性,但是在用去污剂溶解后再冻融细胞 抽提物可引起多亚单位复合物的解离或标记蛋白质降解。


    常见问题

    1. 实验材料中的细胞悬液可以选择如 Jurkat、RBL、K562、BW5147、T 和 B 细胞杂交瘤等,要求是生长于潮湿、37℃、5% 032温箱中或从组织中制备(如淋巴细胞)。

    2. 脉冲标记不会使培养基中的标记物完全丧失,因此标记混合物可以重复使用。收集标记的培养 基,小心地用0.45 μm的滤器滤过。细胞标记前后通过闪烁记数标记混合物来估计未掺人放射活 性的百分比。-20°C冷冻条件下标记的混合物可以保存2个月。


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