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    备择方案 1 对贴壁细胞

    发布时间: 2022-03-10  点击次数: 182次

    原理

    材料与仪器

    贴壁细胞 [35S]标记L-甲硫氨酸(>800 Ci/mmol)/[35S]标记蛋白质水解产物
    PBS(冷冻) 37℃ 脉冲标记培养基
    100 mm 组织培养皿 配有液体同位素垃圾阀门的真空吸气器

    步骤

    1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 细胞,取决于细胞类型)。


    2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体(见基本方案步骤 1)。


    3. 吸弃上清并用 10 ml 预热(37℃)脉冲标记培养基轻柔洗细胞 2 次,弃掉洗液。


    4. 加 5 ml 预热脉冲标记培养基,在潮湿、37℃、5% CO2 培养箱内孵育 15 min,以除去细胞内的甲硫氨酸。


    5. 弃掉细胞上的培养基,加入 2 ml [35S] 甲硫氨酸的工作液体(见步骤 2),在 CO2 培养箱内孵育 10~30 min。


    6. 弃掉细胞上的培养基。用 10 ml 冷冻的 PBS 洗细胞并弃掉 PBS。加 10 ml 冷冻的 PBS,并用塑料刮子或橡胶细胞刮小心刮取收集细胞。


    7. 转移悬液到 15 ml 离心管中,4℃,300 g 离心 5 min,弃上清。如果在标记过程中细胞明显脱落,有必要将含有 [35S] 甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取,并将悬液转移到 15 ml 离心管中,在用 PBS 洗涤前离心。


    8. 可选:通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量(见辅助方案)。

    注意事项

    如果在标记过程中细胞明显脱落,有必要将含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取, 并将悬液转移到15 ml离心管中,在用PBS洗涤前离心。

    常见问题

    1. 实验材料中贴壁细胞,如 HeLa、NRK、Ml、COS - 1、CV - 1,或原代培养的成纤维细胞或内皮细胞。

    2. 如果细胞沉淀不马上使用的话,见基本方案步骤7。

    同实验其他方法

    氨基酸代谢标记实验

    1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸,并用预热的(37℃)脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min,获得悬液中 0.5 × 107~

    备择方案 2 示踪标记细胞

    1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记

    备择方案 3 长期细胞标记

    1. 在预热的 37℃ 长期标记培养基中制备 0.02~0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液(见基本方案步骤 1)。2.1 对于悬浮细胞:用预热的长期标记培养基准备并洗细胞一次

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