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    补体介导法

    发布时间: 2022-03-11  点击次数: 111次

    原理


    带有特异抗原的靶细胞(如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞)与相应抗体结合后,在补体的参与下,引起靶细胞膜损伤,导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。染料(例如:伊红-Y、台盼蓝)可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色,故可用于指示死细胞或濒死细胞,而活细胞不着色。此即补体依赖性细胞毒试验,利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原,亦可鉴定抗体的特异性。
     
    本实验中,Thy-1抗原是小鼠胸腺T细胞特异的表面抗原,在体外利用抗小鼠Thy-1的单克隆抗体通过补体的协同作用,可杀伤95%以上的胸腺细胞。
     


    材料与仪器

    C57BL/6J小鼠
    Hank’s液 单克隆抗体 补体 伊红-Y染液
    眼科剪 眼科镊 平皿 不锈钢网 试管 吸量管 尖吸管 载玻片 盖玻片 显微镜

    步骤


    一、实验方法
     
    1.  小鼠胸腺细胞悬液的制备:将4~6周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死,取出胸腺放入已加入约4 ml冷Hank’s液的平皿中,在100目的不锈钢网上研磨后,过筛,放入试管,离心1 000 rpm,5分钟,用Hank’s液洗两次。将沉淀的细胞重悬于Hank’s液中,配成1×107/ml细胞悬液。
     
    2.  取试管3支,标明顺序,依据下表依次加入1×107/ml胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1的单克隆抗体(最适稀释度)及Hank’s液,放入37℃水浴30分钟。
     
    3.  取出后每管加入1%伊红-Y染液1滴,混匀,室温放置2分钟。
     
    4.  重新混匀后分别在一张载玻片上滴片,加盖玻片镜检。先在低倍镜下观察,再用高倍镜观察,比较3管中细胞死活情况。
     
    二、实验结果
     
    死细胞呈红色,无光泽且肿胀变大;活细胞不着色、有光泽且形态正常。
     
    高倍镜下计数200个细胞并计算其中死细胞的百分数。计算公式如下:死细胞百分数= EQ EQ \F(实验管死细胞数%-对照管死细胞数%,100%-对照管死细胞数%)


    注意事项


    1.  胸腺细胞制备速度要快,且需在冰浴中进行操作,以保持细胞活力;
     
    2.  抗Thy-1的单克隆抗体和补体的效价要在预实验中确定;
     
    3.  细胞对照管死细胞数若超过5%,实验需重新做;
     
    4.  细胞滴加到载玻片上后长时间放置不检测也可导致假阳性反应。


    常见问题


    一、实验材料
     
    1.  解剖器械(眼科剪、眼科镊)、平皿、80~100目不锈钢网;
     
    2.  试管、1 ml吸量管、尖吸管;
     
    3.  载玻片、盖玻片;
     
    4.  C57BL/6J小鼠;
     
    5.  含5%NBS的冷Hank’s液;
     
    6.  抗小鼠Thy-1的单克隆抗体(最适稀释度,本室制备);
     
    7.  补体(豚鼠新鲜血清并经小鼠胸腺细胞吸收,预先测定效价并稀释为最佳稀释度);
     
    8.  1%伊红-Y染液。

    二、多重PCR的特点


    1.高效性


    在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物,或对有多个型别的目的基因进行分型,特别是用一滴血就可检测多种病原体。


    2.系统性


    多重PCR很适宜于成组病原体的检测,如肝炎病毒,肠道致病性细菌,性病,无芽胞厌氧菌,战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。


    3.经济简便性


    多种病原体在同一反应管内同时检出,将大大的节省时间,节省试剂,节约经费开支,为临床提供更多更准确的诊断信息。


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    安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户,提供独特细胞体内可代谢的核酸转染试剂;inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产,包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等,为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务;提供以植物生物为平台基因序列全人源化、独特的细胞培养可分解3D基质胶产品;提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务,努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。



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