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辅助方案 TCA 沉淀测定标记掺入量
发布时间： 2022-03-10 点击次数： 798次原理
材料与仪器
被标记的细胞悬液（见基本方案或备择方案 1～4）
0.1％（m V）BSA／0.02%（m V）NaN3 10%TCA 溶液 冷冻乙醇
连接真空管道的滤过装置 2.5 cm 玻璃微纤维滤膜（Whatman GF／C）步骤
1. 加 10～20 μl 被标记的细胞悬液到 0.1 ml 0.1％（m/V）BSA/0.02％（m/V）NaN3 中，置于冰上。
2. 加 1 ml 冷冻的 10％（m/V）TCA 溶液。剧烈振荡混匀，在冰上孵育 30 min。
3. 在真空滤过装置内，滤过细胞悬液到 2.5 cm 玻璃微纤维滤膜上。
4. 用 5ml 冷冻 10％TCA 溶液洗膜 2 次，再用乙醇洗 2 次。空气干燥 30 min。
5. 在玻璃微纤维滤膜上点同样体积（见步骤 1，10～20 μl）的放射性标记的细胞悬液，在空气中干燥。
6. 转移滤膜到 20 ml 闪烁管里，加 5 ml 闪烁记数溶液，用闪烁记数仪测定放射活性。
7. 计算 TCA 沉淀标记（见步骤 4）与总放射活性的比值（见步骤 5）。
注意事项
１. TCA 有强烈腐蚀性。在制备和操作 TCA 溶液时注意保护眼睛并避免皮肤接触。
2. 洗液应按照混合化学/放射性废弃物处理。根据安全规程进行处理。
常见问题
同实验其他方法
氨基酸代谢标记实验
1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸，并用预热的（37℃）脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min，获得悬液中 0.5 × 107~
备择方案 1 对贴壁细胞
1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 细胞，取决于细胞类型）。2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体（见基本方案步骤 1
备择方案 2 示踪标记细胞
1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞， 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记
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