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    辅助方案 TCA 沉淀测定标记掺入量

    发布时间: 2022-03-10  点击次数: 187次

    原理

    材料与仪器

    被标记的细胞悬液(见基本方案或备择方案 1~4)
    0.1%(m V)BSA/0.02%(m V)NaN3 10%TCA 溶液 冷冻乙醇
    连接真空管道的滤过装置 2.5 cm 玻璃微纤维滤膜(Whatman GF/C)

    步骤

    1. 加 10~20 μl 被标记的细胞悬液到 0.1 ml 0.1%(m/V)BSA/0.02%(m/V)NaN3 中,置于冰上。


    2. 加 1 ml 冷冻的 10%(m/V)TCA 溶液。剧烈振荡混匀,在冰上孵育 30 min。


    3. 在真空滤过装置内,滤过细胞悬液到 2.5 cm 玻璃微纤维滤膜上。


    4. 用 5ml 冷冻 10%TCA 溶液洗膜 2 次,再用乙醇洗 2 次。空气干燥 30 min。


    5. 在玻璃微纤维滤膜上点同样体积(见步骤 1,10~20 μl)的放射性标记的细胞悬液,在空气中干燥。


    6. 转移滤膜到 20 ml 闪烁管里,加 5 ml 闪烁记数溶液,用闪烁记数仪测定放射活性。


    7. 计算 TCA 沉淀标记(见步骤 4)与总放射活性的比值(见步骤 5)。

    注意事项

    1. TCA 有强烈腐蚀性。在制备和操作 TCA 溶液时注意保护眼睛并避免皮肤接触。

    2. 洗液应按照混合化学/放射性废弃物处理。根据安全规程进行处理。

    常见问题

    同实验其他方法

    氨基酸代谢标记实验

    1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸,并用预热的(37℃)脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室温下 300 g 离心 5 min,获得悬液中 0.5 × 107~

    备择方案 1 对贴壁细胞

    1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 细胞,取决于细胞类型)。2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体(见基本方案步骤 1

    备择方案 2 示踪标记细胞

    1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记

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