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    T、B淋巴细胞分离

    发布时间: 2022-03-11  点击次数: 130次

    原理

    淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物(简称AET)处理的绵羊红细胞(SRBC)混合后,其中全部T淋巴细胞均能吸附AET-SRBC,形成牢固稳定而巨大的E-花环,较正常未处理的SRBC形成的E-花环百分比为高,而且形成快速,不易脱落,重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时,AET-E花环易沉于管底,而未形成E-花环的T淋巴细胞,用低渗液解花环周围的 AET-SRBC,便可获得纯T淋巴细胞,而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。

    材料与仪器

    新鲜豚鼠血
    Hanks液 小牛血清 199培养液 生理盐水 氯化钠溶液
    离心管 离心机

    步骤

    1.  AET-RRBC制备


    (1)AET溶液的制备
    称取AET粉剂402毫克,溶于10毫升蒸馏水中,使成为0.143 M 溶液,用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制,不宜久存。

    (2) AET处理RRBC
    取洗涤好压积的RRBC,按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟,每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口(1~2厘米)1800转/分离心5分钟。连续洗涤3-5次,每洗一次,必须充分摇匀,以减少AET-RRBC粘附成团,并观察有无溶血。若有溶血现象,则用含小牛血清的199培养基再洗一次,最后配成10%AET-RRBC悬液,置4℃保存,不得超过5天。

    (3)1%AET-RRBC的配制:
    将预先配制并保存于4℃冰箱的10%浓度的AET-RRBC,以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。

    2.  从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞,操作见后试验。

    3.  AET—E花环试验:
    将分离的单个核细胞(2x106/毫升)与等量1%AET-RRBC混合,置37℃水浴15分钟,每隔5分钟摇匀一次,分装数管,每管2—3毫升,低速离心(1000转/分钟)5分钟后,移至4℃冰箱45分钟。

    4.  T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离
    将形成E-花环的细胞悬液,再用淋巴细胞分层液分离,吸取界面云雾状的细胞,即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E-花环,用Hanks液洗一次后,加双蒸水3毫升处理3分钟,低渗裂解E-花环周围的RRBC,立即加3.5%氯化钠溶液1毫升,使还原为等渗,低速离心沉淀,即得富含T淋巴细胞群。


    注意事项


    1. 分离B细胞过程较长,为了避免B细胞自然死亡,在最后冲洗B细胞时可以用1640,而且要加入5一10%的小牛血清。


    2. 每次洗涤时,不要将试管底部液体吸干,即防止压积的B细胞接触空气。


    3. 使用抗B淋巴细胞血清与受检细胞按NIH方法进行微量B细胞毒试验,使用倒置相差显微镜读数。


    常见问题


    关于从小鼠脾脏中分离:


    1.脾脏组织所含结缔组织比较少,可以直接在筛网上研磨,无需剪碎,也不用顾虑血管。


    2.ficoll中含多聚糖,所以许多人喜欢把它放4度存放,是否室温对实验影响不大脾脏分离淋巴细胞实验比较简单,所以用普通的淋巴细胞分离液就行。


    3 .离心2000rpm×20min,这步很关键,还有就是加细胞悬液时一定要贴壁缓慢加入,不要破坏分界面,分离液与细胞悬液我常用1:2,还有就是所选用的离心管粗细也会影响分层。


    4.中间的悬浮白色环状细胞层即是所要的淋巴细胞层。


    5.洗细胞主要是洗去分离液,所以不能省去。


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