销售热线

19126518388
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > 斑点和狭缝杂交

    斑点和狭缝杂交

    发布时间: 2022-03-24  点击次数: 123次

    材料与仪器

    去离子甲酰胺 甲醛(37%) 20XSSC NaOH 预杂交液
    狭槽 点样器 真空泵 可烫封塑料袋或杂交管 硝酸纤维 K 膜或尼龙膜 Whatman3MJV1 滤纸

    步骤

    一、材料与设备

    1) 狭槽

    2) 点样器

    3) 真空泵

    4) 可烫封塑料袋或杂交管

    5) 硝酸纤维 K 膜或尼龙膜

    6)Whatman3MJV1 滤纸

    7) 去离子甲酰胺

    8) 甲醛(37%)

    9)20XSSC

    10)0.1mol/LNaOH

    11) 预杂交液:50% 甲酰胺,5XSSC,2XDenhardt, 0.1%SDS,100ug/ml 鲑精 DNA。

    二、操作方法

    (-)样品处理

    将 l0ulRNA10ug,(RNA 可多至 50ug) 水溶液与下述溶液混合:

    甲酰胺                                                  20ul

    甲醛(37%)                                                     7ul

    20XSSC                                                          2ul

    于 60℃ 温育 15 min 使其变性,冰浴冷却样品。

    (二)点样

    用 0.lmol/LNaOH 清洗点样器,再用 DEPC 水充分冲洗。将一张经 20XSSC 浸润的 Whatman3 MM 滤纸铺在点样器上,上面铺张经 20XSSC 浸润 30 min 的硝酸纤维素膜,加盖并夹紧,接通真空泵。用 10XSSC 清洗各样孔。在每一 RNA 样品中加 2 倍体积的 20XSSC,混合后加样。于外围几个孔中加染料定位,缓慢抽吸,毎孔用 lml10XSSC 淸洗 2 次。继续抽吸 5 min,吸干滤膜。

    (三) 固定

    取出滤膜,室温晾干后,夹在 2 张 Whatman3 MM 滤纸中间,80℃ 干烤 2 h 以固定RNA

    (四)预杂交

    滤膜烘干后放入可烫封塑料袋 (或杂交管)中,加入 20〜30 ml 预杂交液,密封塑料袋后在 42°C 预杂交 3 h

    (五)探针制备及标记

    参见前面相关章节。

    (六)杂交

    将已标记的探针煮沸变性 l0 min,取出后立即置冰浴 10 min(单链探针不需要变性),将变性探针加入预杂交液中,密封杂交塑料袋后在 42℃ 杂交过夜。

    (七)洗膜

    杂交结束后,分別用下列洗液洗膜:

    1)2XSSC,0.5%SDS,室温洗膜 5 min。

    2)1XSSC,0.1%SDS,42°C 洗膜 30rnin。

    0.1XSSC,0.5%SDS,56℃ 洗膜 30 min。

    (八)检测

    用 X 射线片进行放射性自显影,附加增感屏,一 70°C 曝光 7〜10 天。

    注意事项

    1) 使用快速制备法获得的细胞总 RNA 有可能污染基因组 DNA, 因此难以用分光光度计来精确测定 RNA 含量。此外还必须防止上样矫作物的出现。对半定最分析来说,每一样品须做两次狭缝印迹,一张膜与所要检测的 RNA 探针杂交,另一张则与另-种RNA 探针杂交,这种在各个样品中的表达都应一样,或者也可以对一个样品制作-次印迹,但同一张膜必须进行两次重复杂交。

    2)RNA 样品在点样时要稀释 8 倍,因此样品的浓度至少为 10mg/mL

    3) 狭缝杂交很容易出现假阳性性信号。这可通过以下手段尽可能的避免:①用 Northern 印迹方法严格鉴定探针的特异性;②在所用测试中均需要有适当的阴性对照;③须非常细心地制备所用探针、溶液、RNA 等以避免污染。

    以上就是本期的内容,更多资讯,欢迎点击安培生物网站链接了解更多技术与产品资讯

     

    安培生物科技有限公司介绍:

    安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户,提供独特细胞体内可代谢的核酸转染试剂;inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产,包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等,为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务;提供以植物生物为平台基因序列全人源化、独特的细胞培养可分解3D基质胶产品;提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务,努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。

     

在线咨询
咨询热线

0759-5588931

[关闭]