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    冰冻切片的原位杂交实验

    发布时间: 2022-03-24  点击次数: 136次

    材料与仪器


    冰冻切片
    Tris·Cl EDTA 甘氨酸 PBS SSC 乙醇 甲酰胺 硫酸葡聚糖 DTT NaCl
    加湿盒 水浴锅 培养箱


    步骤


    1.  从冰箱中取出载玻片,平衡至室温,再打开玻片盒。置载玻片于架中,浸泡于以50 mmol/l Tris·Cl(pH7.5)/5 mmol/l EDTA所配的链霉蛋白酶液中,放10 min。
     
    2.  室温下将载玻片浸于含2 mg/ml 甘氨酸的PBS中30 s,然后再于PBS中浸2次,毎次30 s。
     
    3.  浸载玻片于新配的TEA缓沖液中5 min。
     
    4.  在一个烧杯中,配足量TEA缓冲液以没过载玻片。加乙酸肝至终浓度0.25%,迅速倒在载玻片上,晃动玻片架使液体充分混合,放置10 min。

    5.  在2×SSC中洗载玻片2次,每次5 min。
     
    6.  按顺序经30%、60%、80%、95%和100%乙醇依次缦泡脱水,每次浸2 min,干燥切片并马上用于杂交。
     
    7.  沉淀标记的DNA或RNA探针。确定标记掺入的百分率(比活)并估计合成的探针量,并按最终每千碱基0.2 μg/ml 的浓度,估算杂交混合液的终体积,依此重悬探针沉淀。
     
    8.  首先以2份杂交混合液B及2份去离子的甲酰胺重悬探针沉淀,随后加1份50%硫酸葡聚糖,充分混合。
     
    9.  标记的DNA探针煮沸2 min,马上置于冰浴;或于80℃加热标记的RNA探针30 s,维持于50℃。热变性后,加3.3 mol/l DTT至50 mmol/l 终浓度。用加样吸头,加足量探针充分覆盖切片。

    10.  玻片放入密封闭良好的加湿盒中温育4 h,加湿盒中加有加湿盒液B。探针于37 ℃温育探针于42℃温育。

    11.  对DNA探针:以预热至37℃的DNA洗液洗2 h,其间换洗液4~5次。

    12.  对RNA探针:
     
    (1)在预热至50℃的RNA洗液1中洗15 min,至少洗2次。
     
    (2)玻片在37℃的含20 μg/ml 经煮沸处理RNA酶A的0.5 mol/l NaCl / 10 mmol/l Tris·Cl(pH8.0)液中温育15 min。

    (3)在预热至50℃的RNA洗液1中冼15 min至少洗2次。

    (4)在预热至50℃的RNA冼液2中冼15 min,换液2次,(如需要的话,洗片温度可髙至60℃,不过对形态学结果可能有影响)。
     
    13.  在以下各溶液中依次浸泡脱水,每次浸泡2 min:含0.6 mol/l NaCl 的30%乙醇、含0.6 mol/l NaCl 的60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

    14.  于空气中干燥切片后,经放射自显影检测杂交的探针。


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