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    科研小白入门必修之MTT实验操作总结

    发布时间: 2022-06-08  点击次数: 1640次

    MTT实验也叫细胞存活分析实验,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素-C的作用下四氮唑环会开裂,生成紫色的甲䐶结晶,利用DMSO将甲䐶溶解出来之后,再利用吸光度的测定去评估有多少细胞存活。



    细胞增殖实验操作

    1.接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积180ul-200ul.

    2.培养细胞:同一般培养条件,正常培养2-3天也可根据试验目的和要求决定培养时间。

    3.显色:每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。

    4.比色:选择480nm-570nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。


    细胞增殖实验结果计算

    以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线或计算细胞生长抑制率、细胞相对增殖率等。


    前方高能,MTT实验预警

    1.细胞消化。若消化出现问题,则会影响细胞的活性,进而影响 OD 值。对于 MCF-7、BT474等一系列容易消化的细胞,消化时胰蛋白酶中不添加 EDTA,只需胰酶浸润数秒即可。然而,对于caco-2等一系列难以消化的细胞,胰蛋白酶中可添加浓度为 0.25% 的 EDTA。

    2.选择适当得细胞接种浓度。

    3. 结晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后,将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10~20 min,这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解(尤其在冬天)。

    4..避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在显色后尽量吸尽孔内残余培养液,弃去培养液时,吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取,不要触碰底部的紫色结晶;或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。

    5.设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。每组设定3复孔。

    6.MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。

    7.酶联免疫检测仪使用前应打开电源预热半小时。

    8.选择不同的波长,酶联免疫检测仪检测灵敏度不同。应根据实验目的选择相应的波长。




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