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    Biozellen基质胶在小鼠皮下成瘤实验的使用步骤

    发布时间: 2022-08-10  点击次数: 219次

    小鼠皮下成瘤、小鼠皮下血管生成实验准备程序 


    A、细胞房内材料准备、试剂制备及步骤 

    (1) 材料准备: 

    1. 冰盒、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C 缓冲溶液(10X)、4. 含15-20%血清细胞培养液 (例如: 含15-20%血清的 DMEM,DMEM-F12等,不可用 PBS )、5. A 胶 (2X)、6. 细胞培养液、7. 23-26G 针头、8. 1 mL 针筒、9. 细胞。


    (2) 试剂制备: 

    1、C 缓冲溶液 (0.5 X) 制备 : 使用 37 ℃ 水浴回温含15-20%血清的细胞培养液 (例如: 含15-20%血清 的DMEM 或DMEM-F12 等,不可用 PBS ) 稀释 C 缓冲溶液 (10 X) 至 C 缓冲溶液 (0.5 X), 即体积稀释 20 倍。使用前放置 37 度水浴槽。(例如:1 mL C 缓冲溶液 (10 X) + 19 ml 含血清 的DMEM; 若未使用完 毕,可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周) 

    (注1 :若为小鼠皮下血管生成实验,制备C缓冲溶液 (0.5 X)时可加入1500 μM Hearin以及60 μg/ml VEGF。) 

    2、A胶 (1X) 制备 : 将 A胶 (2X) (货号:B--00002-A) 置于37 ℃ 水浴槽回温10分钟,确认完全溶解。再 将 37 ℃ 水浴回温的含15-20%血清的细胞培养液取 0.5 mL,加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mL A胶 (2X), 配置成 1 mL 的 A胶 (1X)。使用前置于37度,可降低黏度。 (单次使用,勿重复冷冻解冻 A胶 (1X) ) 


    (3) 步骤: 

    1、取细胞溶液离心后收集细胞沉淀,与C缓冲溶液 (0.5 X) 均匀混合使细胞浓度为3*106-7 cells/mL。

    2、A胶 (1X) 与步骤 1 含 C缓冲溶液 (0.5 X) 的细胞系悬浮液,按照 2:1 比例均匀混合配置,细胞悬浮液 最终浓度为 106-7 cells/mL。使用前置于37℃,可降低黏度。 (C缓冲溶液用于A胶凝胶反应,例如0.5ml C 缓冲溶液(0.5 X)含细胞 加入 1ml A胶 (1X) 混合成1.5ml 的注射液) 

    (注2 :若为小鼠皮下血管生成实验,可将1500 μM Hearin 以及60 μg/ml VEGF加入C缓冲溶液 (0.5 X),待A胶 (1X) 与含C缓冲溶液 (0.5 X) 的癌细胞悬浮液,依2:1 比例均匀混合后,使Hearin及VEGF最终浓度为:500 μM Hearin以 及20 μg/ml VEGF) 

    3、选用 23-26 G 的针头 (建议选用 24 G) 及 1 mL 针筒,抽取 步骤2 A胶与 C缓冲溶液的细胞混合液至所 需注射体积 (例如:0.2-0.6 mL) 。室温37℃至20℃操作抽取。 (若抽取时发生塞针状态,可先把针头拔掉, 以针筒进行抽取,建议一次抽取配置好所需针筒数量,避免步骤2 溶液过度凝胶,发生塞针)

    4、将抽取好步骤 3 的针筒,带入动物房, 若短时间无法施打建议置于冰上。 



    B、动物房内材料准备及步骤

    (1)材料准备: 

    1. 含 A胶与 C缓冲溶液的细胞混合液的针筒、2. 皮肤消毒剂 (例如 : 酒精)、 3. 手套、4. 实验小鼠、5. 麻醉小鼠的试剂


    (2)步骤: 

    1、室温下可直接注射。若是置于冰盒上的针筒,回到室温后,待液化再进行注射。含A胶与C缓冲溶液的细 胞混合液的针筒,以皮下注射方式,注射实验所需的体积至实验鼠 (建议皮下注射量为 0.2 mL,实际状况 依需求而定)。(针筒放冰上注射阻力会上升, 放室溫会液化注射阻力小。注射时若因凝胶缘故而阻力变大, 需缓慢注射避免针头喷落) 

    注1 : 注射体积可依不同实验目的做调整,若为皮下血管生成研究注射体积需至少0.5 mL以上。 

    注2 : 若为血管生成实验,建议在实验鼠血管丰富的部位进行注射。 

    注3 : 此步骤依实验需求可执行或不执行,若需呈现明显的皮下注射隆起效果,可调整2.试剂制备将C缓冲 溶液 (10 X) 稀释15倍,变成C缓冲溶液 (0.66 X),再执行后续成胶实验;提高C浓度,可提高胶体硬度。

    2、培养一至三周后观察量测接种的肿瘤尺寸。 

    注 4 : 若为血管生成研究,应注射含 VEGF 及 heparin 的 A 胶,以促进血管生成。约三天后,可摘取含有 新血管生成的肿瘤组织。

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