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    原代小鼠心肌成纤维细胞分离培养方法

    发布时间: 2022-10-25  点击次数: 230次
    小鼠心肌成纤维细胞的组织来源于实验动物的正常心脏组织,心脏是脊椎动物身体中最重要的一个器官,主要功能是提供压力,把血液运行至身体各个部分。


    心脏的作用是推动血液流动,向器官、组织提供充足的血流量,以供应氧和各种营养物质,并带走代谢的终产物(如二氧化碳、无机盐、尿素和尿酸等),使细胞维持正常的代谢和功能。
    心脏中,心肌成纤维细胞约占正常心肌组织细胞总数的60%-70%,是心脏中非心肌细胞的主要组成部分,广泛存在于心脏组织中,包围心肌细胞,连接心肌细胞间质,与缺血性心脏病、炎症、肥大、梗死等病理状态密切相关。细胞生长方式以长梭状细胞,贴壁培养。
    小鼠心肌成纤维细胞的方法有很多,赛百慷提供的心肌成纤维细胞分离方法有两种,一种是贴块法,一种是消化法,这两种方法都可以用于分离和培养原代细胞。





    实验器械
    1.培养皿
    2.T-25细胞培养瓶
    3.100目不锈钢网筛
    4.200目不锈钢网筛
    5.眼科剪
    6.眼科镊
    7.离心管(15ml、50ml)

    实验分离和培养步骤
    1. 小鼠颈椎脱臼处死后,剃除腹胸部的被毛,放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。



    2. 取出小鼠,在无菌环境下打开胸腔,取出心脏组织,注入盛有无菌1×PBS的培养皿中,洗净组织表面的血液。
    3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞,浸泡完成后立即转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
    4. 清洗完成后,用剪刀镊子配合除去主动脉弓和心房组织,仅保留心室部分,再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
    5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块,之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。     
     
    A.贴块法



    6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中,用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织,室温消化3-5min。
    7. 消化完成后,添加数毫升FBS终止消化,之后吸弃液体,加PBS清洗组织块1次后,用200ul吸头将组织块平均接种于T-25培养瓶的培养面上,之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中,静置2-4h。
    8. 待组织处于略微脱水的状态时,小心添加2ml完培养基,添加时注意尽量不要将组织块冲起,要使培养基接触所有的组织块。
    9. 之后放入培养箱中继续培养,一般2-4天后成纤维细胞会从组织块周围爬出,待爬出的细胞有较多数量时,可将细胞消化下来,去除组织块,转入另一培养瓶中培养。
     
    B.消化法
    6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中,加入混合消化液(0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶)37℃水浴消化8min后,吸取上层混悬液弃去。
    7. 余下组织加入混合消化液10ml,37℃水浴震荡消化10min;吸取上层悬液至另一离心管中,加入适量FBS终止反应;剩余沉淀物再加消化液消化3-5次,直至组织块消化。
    8. 按1∶1加入含血清的培养基,中止酶反应,悬液过150目网筛去除较大的组织块。
    9. 收集全部中止后的消化液于离心管中,300g,离心10 min,弃去上清,加入培养液重悬细胞后计活细胞数。
    10. 调整细胞密度以1× 106个/ml 接种入的T-25培养瓶中,每瓶添加2ml细胞悬液。
    11. 培养瓶放置于37℃,5% CO2培养箱中静置40min后,吸弃上清液以去除未贴壁的非成纤维细胞和死细胞,再添加5ml完培养基继续培养。



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