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    原代角质形成细胞的分离培养方法

    发布时间: 2022-10-25  点击次数: 199次
    为什么越来越多的生物实验开始使用原代细胞?

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    原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多,人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究,因为细胞系常常由于体外长期培养,而容易丢失原有的生物学特性,对药物处理的反应差距越来越大。

    原代细胞刚从组织中分离开,生物学特性未发生很大变化,仍保留原来的遗传特性,也*为接近和反应体内生长特性,原代细胞的活力和生长状态都比较好,细胞的纯度和基因保留可达到90%以上,适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等试验研究,使用原代细胞进行实验,可以获得更准确的研究和数据。

     

    角质形成细胞

     

    角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞,其分化的最终阶是形成角蛋白。根据角质形成细胞的发展阶段和特点,从内向外可将其分为五层。基底细胞层又称生发层,棘细胞层,颗粒层,透明层,角质层。

     

    角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。在单一移行过程中,角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化,从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。

    新生的基底细胞进入棘细胞层,然后上移到颗粒层的最上层。细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织,细胞生长状态为贴壁培养。

     

    需要的实验试剂

     

    1.培养基1:iCell原代角质细胞培养体系

    4.基础培养基:DMEM/F12

    5.缓冲液:无菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S,pH=7.4

    6.消化液1:1.2U/ml的dispase Ⅱ

    7.消化液2:0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA

    8.消化液3:0.1%Ⅰ型胶原酶

    9.75%医用酒精

    10.胎牛血清(FBS)

     

    实验器械

     

    1.培养皿

    2.T-25细胞培养瓶

    3.100目不锈钢网筛

    4.200目不锈钢网筛

    5.眼科剪

    6.眼科镊

    7.离心管(15ml、50ml)

     

    实验步骤

     

    1.新鲜的包皮组织,装盛于含有无菌生理盐水或1×PBS的无菌容器中,于保温盒中,冰上放置离体6h内运输到实验室进行后续分离。

    2.在无菌环境中取出包皮组织,用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后,75%的酒精浸泡100s

    3.酒精浸泡组织后快速将组织转入装有1×PBS的培养皿中震荡清洗数次以去除酒精,然后用眼科剪小心剪去皮下组织(脂肪,微血管等)

    4.将去除了脂肪和微血管组织的再用1×PBS清洗几次后,剪成3mm*8mm左右的皮片,用消化液1  4度消化过夜(15-18h)。

    5.第二天,用2个眼科镊子小心撕开过夜消化的皮肤组织,分离真皮和表皮;

    6.分离的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。

    7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右,然后用含血清的培养基终止消化,过200目不锈钢网筛后取滤悬液,转入15ml离心管中,400g离心10分钟,离心完成后弃去上清,沉淀用3ml的1×PBS吹打重悬后,400g离心5min离心完成后弃去上清,沉淀用2ml的原代角质细胞培养基吹打重悬后,转入已经装有2ml培养基的T-25培养瓶中,将培养瓶置于37℃的二氧化碳培养箱中培养。

     

    8.视细胞贴壁情况48-72h后换液去除未贴壁的细胞,之后继续培养,视细胞生长状况和培养基颜色每2-3d换液一次;待细胞贴壁率达到80-90%后,进行常规传代扩增操作(角质细胞对胰酶不太敏感,消化时间可能会增加到10-15分钟,有时需要配合使用无菌细胞刮铲进行传代)。

     

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