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    如何才能把细胞培养好?

    发布时间: 2022-11-01  点击次数: 362次


    一、细胞培养的基本概念

    (1)基本概念


    细胞培养:狭义的细胞培养主要是指分离(散)细胞培养,广义的细胞培养还包括单(个)细胞培养又称克隆(clone),是指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。

     

    原代培养:即第一次培养,指将培养物放在体外生长环境中持续培养,中途不分割培养物的培养过程。

     

    传代:原代培养成功后,随着培养时间的延长和细胞不断分裂,一则细胞之间相互接触发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另一方面因营养物不足和代谢物积累不利于生长或发生中毒。需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内,再进行培养。这个过程称为传代或者再培养。

     

    细胞系:原代培养物经首传代成功后,即成细胞系。如细胞系不能继续传代或传代数有限,称为有限细胞系,它由原代培养中的许多细胞系列组成。如细胞系可连续传代,则称为连续细胞系,即已建成的细胞系。

     

    细胞株:通过筛选或克隆化,且有特殊性质或特异标记的细胞。这些特性在以后的培养中必须持续存在。这些特性包括具有一定的标记染色体,对某种病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。 



    二、细胞的生长

    (1)生长方式

     

    贴附生长:必须贴附于支持物表面才能生长。

    悬浮生长:于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面。



    (2)生长过程


    游离期:细胞接种后在培养液中呈悬浮状态,也称悬浮期。此时细胞质回缩,胞体呈圆球形。10min-4h。


    贴壁期:细胞附着于底物上,游离期结束。细胞株平均在10min-4h贴壁。底物:胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白(生长基质),这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质(化学合成的功能基团)。


    潜伏期:此时细胞有生长话动,而无细胞分裂。细胞株潜伏期般为6~24小时。


    对数生长期:细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最为适合进行实验研究。


    停止期(平台期):细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂,机制:接触抑制、密度依赖性。


    (3)生长条件

    细胞的营养需,细胞的生存环境,温度:37℃,O2,CO2:5%,pH:7.2-7.4,渗透压,无污染,无毒。




    三、常用的器材与试剂

    (1)常用仪器

    超净工作台:为细胞操作提供无菌环境。紫外灯:紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。


    滤器:过滤除菌:大多数培养用液,如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。



    电热干燥箱:干热消毒(160℃,2h)。主要用干玻璃器皿消毒。


    压力蒸汽消毒器:湿热消毒,用途广。


    CO2培养箱:CO2培养箱设定的条件:37℃,5%CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题:


    ①用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气。

    ②保持培养箱内空气干净。定期消毒(90℃,14h)。

    ③箱内火菌蒸馏水 3000ml 蒸馏水槽中以保持箱内湿度,避兔培养液蒸发。

     

    其它仪器:倒置显微镜,酶标仪,微孔板震荡器,液氮罐,自动双重纯水蒸馏器,纯水仪等。


    (2)常用耗材


    耗材:培养瓶,吸管,培养板,冻存管,酒精灯


    (3)常用试剂

    • 消化液

    胰蛋白酶:是一种黄白色粉末,用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25%。用滤器过滤除菌,如经费充裕可以直接购买已经配制好的胰酶,无需自己配制。


    胰蛋白酶作用机制:胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。


    胰蛋白酶液消化时间:2-10 min。可用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。


    • 培养基

    培养基(培养液):是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。


    天然培养基:天然培养基有血清、血浆、和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。优点:营养成分丰富,培养效果好。缺点:来源受限。成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。


    合成培养基:合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基,如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分:氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点:标准化生产,组分和含量相对固定,成本低。缺点:缺少某些成分,不能全满足体外细胞生长需要,只能维持细胞生存,要想使细胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如血清)。


    • 血清培养基

    血清中含有:①多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等)②多种金属离子③激素;④促贴附物质,如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分。


    常用血清:胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等,其中以胎牛血清质量为好。


    血清质量好坏是实验成败的关键,优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活(消除补体活性):56℃,30min。血清的消毒:过滤除菌。


    • 抗菌素的使用

    抗生素的作用:在培养液配制后,培养液内常加适量抗菌素,以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素最终使用浓度为每毫升100单位,方便、广谱、稳定。

     

    • 完培的组成

    基础培养基80%一95%,血清5%-20%,碳酸氢钠2.0g/L,青、链霉素各100单位/毫升。



    四、细胞的传代方式

    (1)悬浮细胞



    直接传代法:悬浮细胞沉淀在瓶壁时,将上清培养液去除l/2-2/3,然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。


    离心法传代:离心(1000 r/min)去上清,沉淀物加新培养液后再混匀传代。


    (2)半悬浮细胞

    此类细胞部分呈现贴壁生长现象,但贴壁不牢,可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来,进行传代。


    (3)贴壁细胞

    采用酶消化法传代,常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。


    详细步骤:

    1、吸光培养瓶中的培养基,加入1-2ml PBS清洗2-3遍,吸出PBS。

    2、加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液,以消化液能覆盖整个瓶底为准。

    3、静置2-10min(具体时间根据细胞状态确定),显微镜下动态监测,当细胞消化全,立即加入含血清培养基,终止消化。

    4、转移至离心管,离心(800r/min,5min)。

    5、吸去胰蛋白酶液,加入培养液,反复吹打细胞沉淀,混匀,形成细胞悬液。

    6、吸取适量细胞悬液,接种于新的培养瓶内。

    7、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内,然后放入培养箱中培养。



    五、细胞的冻存与复苏



    (1)冻存和复苏的原则


    慢冻快融,当细胞冷到0℃以下,可以产生以下变化:细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反结晶就大,大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶。


    (2)慢冻程序

    方法一:当温度在-25℃以上时,-1~-2℃/min;当温度达-25℃以下时,-5~-10℃/min;当温度达-100℃时,可迅速放入液氮中细胞冻存。


    方法二:冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降-1~-3℃至-80℃以下,再放入液氮长期保存。


    方法三:购买无血清快速细胞冻存液,可以省掉程序降温的步骤,直接冻存。补充:一般冻存液的配置:90%血清+10%DMSO。


    (3)基低温保护剂的应用

    在细胞冻存时加入低温保护剂,能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。


    (4)细胞冻存步骤

    1、预先配制冻存液:含20%血清培养基10%DMSO

    2、取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1×106~5×106细胞/ml)

    3、加入1ml细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

    4、按照慢冻程序对细胞进行冻存。


    (5)细胞复苏步骤

    1、从液氮中取出冷冻管,迅速投入37℃水浴锅,使其融化(1分钟左右)。

    2、立即转移至离心管,加入适量培养液。

    3、以800r/min离心5分钟。

    4、去上清,加新鲜培养液,吹打混匀成细胞悬液,转移至培养瓶,放入培养箱培养。



    六、细胞计数

    (1)人工计数法

    吹打待测细胞悬液中细胞,使其在悬液内分布均匀,这样只需测定很小一部分体积的细胞悬液中的细胞数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。


    酒精消毒计数板:用酒精棉将细胞计数板和盖玻片全擦拭干净,并将盖玻片盖于细胞计数板上;


    转移盖玻片:吸取10 ul单细胞悬液,并沿着盖玻片边缘滴加,使细胞悬液填满盖玻片和计数板之间区域,注意避免产生气泡,细胞悬液亦不能流入计数板的边槽中,之后静置3 min;


    数细胞:随机选取计数板上其中4大格并记录4大格中的细胞总数,压线的细胞按照数上不数下,数左不数右的原则,之后按照以下公式进行计算:

    细胞数/mL=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数



    七、注意事项

    (1)注意事项

    计数前:计数前,注意吸尽培养皿里的细胞,充分混匀,使细胞分散成单个细胞。


    实验操作台:实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。


    吸管:吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼,因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜,再用时会把有害物带入营养液中。


    手:不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部,吸管前部等所有可能与细胞接触的部分,如已接触,要用火焰烧灼消毒或取备品更换。


    火焰灭菌时间:开启、关闭长有细胞的培养瓶时,火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。


    换液:换液时倾倒废液,瓶口不能接触废液缸,速度不能过快,防止废液四溅。


    吹打细胞:吹打细胞时,要注意边角的细胞是否吹打下来。


    相对较脏的物品:手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上,即不可以在开放容器上方操作。


    交叉污染:每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染。


    自身的安全:注意自身的安全,对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂例如DMSO,并避免尖锐物品伤人等。


    冻存:从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液。将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤。冻存和复苏最好用新配制的培养液。


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    安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户,提供*细胞体内可代谢的核酸转染试剂;inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产,包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等,为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务;提供以植物生物为平台基因序列全人源化、*的细胞培养可分解3D基质胶产品;提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务,努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业


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