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    蛋白质合成实验

    发布时间: 2022-12-05  点击次数: 130次

    材料与仪器

    步骤


    材料

    无菌

    细胞培养,如 1X104~ 1X106 个细胞,24 孔板
    3H-亮氨酸。无血淸培养基中 2 MBq /ml (~50uCi/ml) (特异活性并不重要,因为它将由培养基中的亮氨酸浓度决定)

    非无菌

    SLS 或 SDS,1% (35m mol/L ) 溶于 0 .3 mol/L NaOH
    三氯醋酸(TCA)
    液闪瓶
    Eppendorf 管
    闪烁液,最小含水为 10%

    操作步骤

    1. 细胞生长至所需密度。

    2. 从孵箱中取出培养板,加人预温的溶于培养液或 BSS 中的放射性同位素,稀释度为 1:10 (如 l00ul/ml/孔)。

    3. 尽快地将细胞放回孵箱。

    4 . 继续培养 4~24 h。

    提示: 不同的蛋白质更新率不尽相同。本操作程序并不针对任何特定的一种蛋白质,而可用于快速生长细胞中的总蛋白。当第一次用来测定一个细胞系的蛋白质合成时,要核实合成率在所选的孵育时间内是否呈线性。如果氨基酸池比饱和时低,可发生延迟。

    5 . 从孵箱中取出培养物,小心从孔中吸去培养液至适当的废弃放射性液体容器中(见 7.7.2 节)。
    1. 用冷 HBSS 或 D-PBSA 轻轻地清洗细胞。

    提示 某些单层培养,特别是一些松散贴附的连续细胞系,诸如 HeLa-S , 可能在清洗时便离散开来。如遇这种情况,移去同位素,并加入甲醇,将单层固定,静止 lO min,小心地移走甲醇,令其晾干。

    7.将培养板置于冰上,加人 0.6mol/L TCA ,于 4°C 静置 lO min ,:然后吸去所有未掺入的前体物。

    8. 重复第七步 2 次,但每次只许 5 min 。

    9 . 以 MeOH 清洗培养物,晾干培养板。

    10.加人 0.5 ml 0.3mol/L NaOH ,内含 1% SLS,室温下静置 30 min 。

    11. 混合每孔中的培养物,将它们移人液闪瓶中。

    12. 加入 5m l 闪烁液,在闪烁仪中计数。

    提示: 生物降解性闪烁剂(如 Ecoscint),比以甲苯或二甲苯为基础的闪烁液更好,因为只要是放射活性低于规定量,前者毒性较小,可以与大量的水一起倒入水池 中。对于悬浮培养的细胞,在第 5 步用 1000 g 离心 l0 min ,去除培养基,除了第 9 步外 6,7 ,8 也须重复此步骤,第 9 步的培养板也可在磷光成像仪(phosphorimager) 上直接定量测定。



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