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    大鼠肝细胞分离实验

    发布时间: 2022-12-05  点击次数: 142次

    原理


    经肝门静脉或肝门静脉分支插管,用无钙缓冲液灌洗肝 15 min,再用酶溶液灌洗 15 min。收集和洗涤细胞,计数有活力的肝细胞。


    材料与仪器

    L-15 Leibovitz 培养液 Ham F12 培养液 胞培养液 HMM SF 无钙 HEPES 缓冲液 胶原蛋白酶液 5% 戊芭比妥钠 肝素
    聚乙稀管 一次性 20 G 头皮静脉输液针 缝合线 l 注射器 水浴箱 蝠动泵

    步骤


    一、材料

    1. 无菌

    (1)L-15 Leibovitz 培养液


    (2)Ham F12 培养液或 WilliamE 培养液:80~100 ml,含有 0.2% 牛白蛋白(V 级,Sigma) 和 1 ug/ml 牛胰岛素


    (3)胞培养液(hepatocyte minimalmediu,HMM ):67.5% EMEM 和 22.5%199 培养液,或用 William E 培养液代替这两种培养液。添加 5ug/ml 牛胰岛素、lmg/ml BSA、20 mmol/L 丙酮酸钠、100U/ml 青霉素、100 Mg/ml 链霉素和 20%FBS


    (4)HMM/SF:无血清 HMM ,添加 10-5mol/L 氢化可的(木公)半琥珀酸酯


    (5)无钙 HEPES 缓冲液:含有 160.8 mmol/L NaCl、3.15 mmol/L KCl、0.7 mmol/L Na2 HPO4·12 H2O 和 33 mmol/L HEPES,pH 7.65。用 0.22, 又微孔滤器过滤除菌,在 4℃ 条件下储存,可存放 2 个月


    (6)胶原蛋白酶液:含有 0.025% 胶原蛋白酶(I 级,Sigma; 或 Boche,103578) 和 0.075% CaCl2·2 H2O,用 pH 7.65 的无钙 HEPES 缓冲液配制。使用前配制,并用滤器过滤除菌


    (7)5% 戊比妥钠(Abbott)


    (8)肝素(Roche)


    (9)聚乙稀管:内径为 3 mm ,外径 5 mm


    (10)一次性 20 G 头皮静脉输液针(Dubernard Hospital Laboratory,Bordeaux,France)


    (11)插管用的缝合线


    (12)刻度瓶和 Petri 培养皿


    (13)手术器械:尖剪、直剪、弯剪和手术夹


    (14)2 支二次性 1 ml 注射器

    2. 非灭菌

    (1)计时器


    (2)蝠动泵:10~200r/min


    (3)水浴箱

    二、操作步骤

    1. 用水浴箱将 HEPES 缓冲洗液和胶原蛋白酶液预热,一般 38~39℃,进人肝内时为 37℃。不需要加氧。

    2. 将螺动架的流速设定在 30 ml/min。

    3. 腹膜腔注射戊芭比妥钠(每 100 g 体重注射 150ul),将大鼠(180~200 g ) 麻醉。然后,经股静脉注射 10001U 肝索。

    4. 用 70% 乙醇擦洗大鼠腹侧面。

    5. 切开腹壁,在离肝约 5 mm 处将结扎线系于肝门静脉上。朝肝的方向插管后,结扎肝门静脉。

    6. 为了避免压力过高,迅速剪开肝静脉。以流速 30 ml/min 灌注 500 ml 无钙 HEPES 缓冲液。几秒钟内确认肝变白。

    7. 以流速 15 ml/min 灌注 300 ml 胶原蛋白酶液。肝变得肿胀。

    8. 切除肝,用 HEPES 缓冲液冲洗。

    9. 剥离 Glisson 囊后,用 100 ml L-15 Leibovitz 培养液分散细胞。

    10. 用两层纱布或孔径为 60~80um 的尼龙网过滤细胞悬液。通常在室温条件下,让有活力的细胞沉淀 20 min 。然后,吸去 60 ml 含有细胞碎片和死细胞的上清液。

    11. 通过缓慢离心(50 g,40s) 洗细胞 3 次,以除去胶原蛋白酶、损伤细胞和非实质性细胞。

    12. 用 HMM 混悬分离的肝细胞。

    13.2~3 h 后,活细胞会贴壁,并开始伸展。吸去含有死细胞的上清液。

    14. 细胞贴壁后,用 HMM/SF 替代含有 FBS 的 HMM。此后,每天换培养液。



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