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    脂质体介导的瞬时转染

    发布时间: 2022-12-06  点击次数: 138次

    材料与仪器

    L8057-Y10细胞 D-PBSA
    培养瓶 培养板 F12 FB培养基 G418(Invitrogen) 选择性培养基 电穿孔 电穿孔专用杯 电穿孔仪II 电穿孔仪-II配套的效能扩增器-Plus

    步骤

    表达载体与 DNA 制备:

    pSVTKGH,线性化 [ Selden et al.,1986]

    此载体含有 SV 40 增强子及单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子序列,两者可启动人类生 K 激素(hGH ) 基因表达。hGH 可直接分泌到组织培养基上,可通过放射免疫学分析法直接检测 [ Ravid et al.,1991 ]。

    pcDNA3,线性化(Invitrogen )

    该表达载体在多克隆位点上游含有人类巨细胞病毒增强子-启动子,下游含多聚腺苷酸信号及牛生长激素(bGH ) 基因的转录终止序列。pcDNA3 载体还含有新霉素抗药基因,用作筛选稳定表达目的基因的抗性克隆。如本章方法中所述,pcDNA3 也可用作与报告基因载体共转染的筛选标记。

    1. 以 5X105个/ml 的浓度在 75 cm2 培养瓶中接种 L8057-Y10 细胞(F12/FB 培养基)(含谷氨酰胺(2 mmol/L ),青霉素(50 U/ml ) 及链霉素(5 μg/ml ) 的 Ham’s F12 , 添加 10% FBS (热灭活;GIBCO #16140-014)),并于 37°C,5% CO2 孵箱培养细胞。

    2. 在对数生长后期,收集细胞,4°C ,380 g 离心 5 min。

    3. 用 10ml D-PBSA 洗涤细胞沉淀,4°C,380 g 离心 5 min。

    4. 用 5 ml 电穿孔缓冲液洗涤细胞沉淀,用血细胞计数仪计数细胞。

    5. 4°C,380 g 再次离心 5 min,收集细胞。

    6. 用电穿孔缓冲液将细胞制成密度为 1X106 个/0.8 ml 的细胞悬液。

    7. 将 0.8 ml 的细胞移至预冷的电穿孔杯中。

    8. 分别加入 50 μg 和 5 μg 线性 pSVTKGH 及线性 pcDNA3 (如果实验目的是检测特异基因启动子-报告基因表达,还需另设无质粒 DNA 的电穿孔细胞,作为阴性对照)

    9. 一只手紧握电穿孔杯,另一只手轻弹底部,以混匀 DNA-细胞悬液,将悬液于冰上孵育 10 min。

    10. 在 400V /500 μF 条件下轰击细胞悬液,并记录时间。

    11. 之后,取出电穿孔杯,在冰上搁置 10 min。

    12. 将轰击后的细胞移至盛有 10 ml F12/FB 的离心管中,另取少许培养基冲洗电穿孔杯,移回到离心管,离心,收集细胞。

    13. 将细胞于 20 m l F12/FB 中再次悬浮,种到 75 cm2 培养瓶中,于37°C ,5 %CO2 培养箱中孵育,令新霉素抗性基因表达。

    14. 24~48 h 后,离心收集细胞,然后用 20 ml 选择性培养基中再次悬浮细胞。

    15. 随后,需每 2~4 天换液(选择性培养基),以清除死亡细胞的碎片,并且使抗性细胞生长,筛选过程至少需要两周。

    16. 测定 hGH 在细胞上清液的表达(见 27. 11.5 节)。


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