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    复苏冻存细胞实验

    发布时间: 2022-12-06  点击次数: 169次

    原理

    快速复苏细胞,缓慢稀释,以高细胞密度重新接种。


    材料与仪器


    步骤

    材料

    无菌

    培养瓶(如果需要离心时)

    生长培养基

    吸量管,1ml,10ml

    注射器和19号针头(如果你使用玻璃冻存管)

    非灭菌

    保护性手套和面罩

    37℃无菌水,10cm深,盛于清洁、用乙醇擦拭过的带盖的水桶中

    镊子

    70%乙醇

    棉签

    1%萘黑(酰胺黑)或0.4%台盼蓝

    操作步骤

    1.检查冻存目录,确定将要复苏的冻存管的位置

    2.收集所有材料,准备培养基,标记培养瓶

    3.从冻存罐中取出冻存管,检查标签,确定是否是所需要的冻存管,若小管未浸没在液氮中,将小管放入塑料除菌水桶内37℃的烧杯中。尽可能避免水没过官帽,因为会增加污染的机会。

    安全提示

    将冻存管从液氮中取出时,必须穿实验衣,戴手套。若冻存管浸没在液氮中,则必须待面罩或护目镜,也必须穿实验衣戴手套。储存在液氮中的冻存管,包括塑料小管都可能吸入液氮,复苏时将可能发生剧烈爆炸。该种情况下,必须使用带盖的塑料水桶进行复苏,以控制-爆-炸。

    4.当冻存管复苏时,再次检查标签以确定为所需的细胞;随后用70%乙醇彻-底擦洗冻存管,然后在超净工作台内打开冻存管,

    5.用1ml吸管将冻存管内含物转移至培养瓶中。

    6.将培养基缓慢的加至细胞悬液中:以每2min 10ml的速率进行滴加。开始时逐滴加入,然后可加快,逐渐稀释细胞和细胞保护剂。

    对于需要通过离心去除细胞保护剂的细胞:

    (a)按照步骤6,在离心管或常规容器内缓慢稀释细胞。

    (b)100g离心2min。

    (c)弃去含有细胞保护剂的上清培养液。

    (d)以新鲜培养基重新悬浮细胞。

    (e)接种入培养瓶。

    7.冻存管内残留物可用萘黑或台盼蓝染色,以测定细胞的存活率。

    8.24h后检查:

    (a)对于贴壁单层细胞,依据预测密度(个细胞/cm2)的细胞照片,确认细胞是否贴壁,估计细胞存活率。

    (b)对于悬浮生长的细胞,检查外观(清晰的细胞质,缺乏细胞颗粒),稀释至常规的接种浓度。若进行细胞技术,并估计细胞存活率后,接种浓度可能更精确,这种情况下, 可以将细胞稀释至常规存活细胞接种浓度。

    注意事项


    1. 将冻存管从液氮中取出时,必须穿实验衣,戴手套。若冻存管浸没在液氮中,则必须待面罩或护目镜,也必须穿实验衣戴手套。储存在液氮中的冻存管,包括塑料小管都可能吸入液氮,复苏时将可能发生剧烈爆炸。该种情况下,必须使用带盖的塑料水桶进行复苏,以控制-爆-炸。


    2. 塑料冻存管在使用前要仔细检查,以防管壁破裂或螺口不配套造成密封 不严。


    3. 用DMSO作为冻存保护剂时,用前应先将冻存液在4℃预冷,解冻后应马 上洗去保护剂。


    常见问题


    1. 检查细胞活率。用1ml培养液重悬细胞,台盼蓝染料排除法检查细胞存活率。


    2. DMSO有-剧-毒,使用时要特别注意。此外,在冻存前越晚加入细胞越好,解冻后要尽快除去,以避免对细胞的毒害。


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