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    放射自显影术实验

    发布时间: 2022-12-06  点击次数: 172次

    简介


    培养细胞的放射自显影术射性既可以研究细胞本身的物质代谢之外,还可用来分析细胞的动态活动、细胞周期等。


    原理


    培养细胞放射自显影术原理是将培养细胞的放射性同位素释放射线,作用于感光乳胶,使感光乳胶中的卤化银感光形成潜影,再经显影剂作用,感光的卤化银还原成黑色的银颗粒,未感光的银盐则经定影去除,在乳胶中留下清楚明确的图像。 


    材料与仪器


    器材:
    ① 培养的细胞
    ② 细胞传代培养的设备
    ③ 直径 3.5 cm 塑料培养皿(或 50 ml 培养瓶)
    ④ 2.2 cm x 2.2 cm 盖片(或自裁成 6 mm x 40 mm,放入培养瓶)
    ⑤ 曝光铅盒或黑色塑料盒
    ⑥ 电磁搅拌器
    ⑦ 恒温台(可调节温度以烘干乳胶)
    ⑧ 载片
    ⑨ 中性树胶
    ⑩ 暗室及相应设备
    试剂:
    ① 同位素标记物(如 3 H-TdR、3 H-UdR 等)
    ② 液体乳胶(常用核 IN 号)
    ③ 显影液
    ④ 定影液
    ⑤ 甲醇
    ⑥ 吉姆萨染液


    步骤


    培养细胞放射自显影术的基本过程可分为以下几步:
    (1)同位素标记物与细胞的结合
    A. 用培养基稀释同位素标记物,培养细胞放射自显术常用浓度为 0.1~2 μ Ci/ml。如采用 3 H-TdR,建议浓度为 0.5~1 μ Ci/ml。
    B. 弃去培养细胞的培养基,用 Hanks 缓冲液洗涮 1 次,加入上述含有同位素的培养基。一般 50 ml 培养瓶加 3 ml 培养液。
    C. 将上述细胞置 37 ℃ 恒温箱温育一定时期(温育时间按实验要求和同位素种类及浓度等因素而定,一般如 3 H-TdR 在 1 μ Ci/ml 浓度下,温育 1~4 h 即可),然后弃去培养液,用 Hanks 液涮洗 3 次,以去除未掺入细胞内的放射性物质。
    (2)固定
    按常规细胞学方法进行,但应避免使用含有重金属离子的固定液,以免增加本底颗粒数目。建议用纯甲醇固定,时间 30 min 以上。
    (3)涂布乳胶
    A. 乳胶的准备于暗室中红光下,将核 IN 乳胶从不透光的容器中取出,置于 10 ml 小烧杯中,将小烧杯置于电磁搅拌器上,放入洁净铁芯小玻棒 1 枚,开启电磁搅拌器,使乳胶化,为稀释起见,可加入适量附加液或三蒸水,搅拌数分钟使乳胶与附加液充分混合均匀。如无电磁搅拌器,可将三蒸水 40 ℃ 预热,然后加入等量或 2/3 量的核 IN 乳胶,用干净玻棒搅拌均匀,应避免出气泡。
    B. 将生长有培养细胞的小盖片条(或培养皿中的方盖片)取出,将其一端用胶布粘于载片上(注意:使有细胞的一面朝上,此面外观较粗糙),然后在有细胞的盖片上滴 1 滴乳胶,用吸管将乳胶轻轻涂开。
    C. 将上述涂有乳胶的玻片直立于切片架上,使乳胶尽量成为薄层,再以低速小风扇吹干。
    D. 待乳胶干硬后(10~20 min),将片子置于预先置有干燥剂(常用硅胶或氯化钙)的曝光盒内,用黑纸将曝光盒包严,注明同位素标本记号,置 4 ℃ 冰箱内,或室温下曝光。
    (4)曝光
    曝光时间随标本的放射性强度、同位素剂量和实验要求而定。为阐明同位素在细胞和组织内的精确定位,曝光时间要短;为了显示小量放射性同位素的定位,曝光时间宜长。对半衰期长的同位素,活性小的标本应相应地增加曝光时间。为选择最佳曝光时间,可参考同类的工作,一般应进行试验性曝光,以决定最佳曝光时间。3 H、C、35 S 标记物通常曝光 3~7 d 即可。
    (5)显影与定影
    显影与定影时间随曝光时间和同位素剂量而不同,在一般照相的显影液中,于 18~20 ℃ 时,显影 3~5 min,然后在 1% 乙酸溶液中置 1~3 min,再转入定影液内 30 min 左右。
    (6)染色
    将标本用自来水连续冲洗数分钟(切忌水流过急、过大),再以三蒸水洗涮 1 次,晾干后用吉姆萨染色(也可用 HE 染色)。
    (7)封片
    染色后晾干,用中性树胶封片,在油镜下观察、摄影。


    注意事项


    1. 涂布乳胶有各种方法,其原则是涂布要均匀一致,此外尽可能地要稀薄。
    2. 从涂布乳胶开始须在暗室内进行,直至定影完毕方可见光。
    3. 同位素废弃物处理须严格按要求执行,不可污染环境。


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