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    非肌肉肌动蛋白的纯化

    发布时间: 2022-12-06  点击次数: 125次

    材料与仪器

    非肌肉肌动蛋白
    DNA 酶Ⅰ缓冲液
    DEAE 柱

    步骤

    1. 准备贮存液和材料。

    2x DNA 酶Ⅰ缓冲液:

    20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0

    1 mmol/L DTT

    0.4 mmol/L CaCI2

    0.4 mmol/L ATP

    抑蛋白酶肽

    抑蛋白酶

    亮抑蛋白酶肽

    抑胃酶肽 A

    PMSF

    TPCK

    50% 甲醛在 DNA 酶柱缓冲液中

    0.4 mol/L NH4CI 在 DNA 酶Ⅰ缓冲液中

    0.3 mol/L KCl 在 DNA 酶Ⅰ缓冲液中

    DNA酶Ⅰ柱缓冲液

    2. 准备一个 5~10 ml 的 DNA 酶Ⅰ的亲和柱。

    3. 准备一个 0.2 ~1 ml 的 DEAE 柱:用 DNA 酶Ⅰ缓冲液平衡的 DEAE-纤维素。

    4. 通过离心收集细胞并用等渗盐溶液(例如 PBS ) 洗去培养液。

    5. 在加蛋白酶抑制剂的 DNA 酶柱缓冲液中重悬细胞沉淀物。

    6. 用对于感兴趣细胞的标准方法进行细胞匀浆。

    7. 用相差显微镜证实超过 99% 的细胞已经裂解了。

    8. 100000 g 离心裂解物 45 分钟。

    9. 用巴斯德吸管转移上清,避免混入脂肪。

    10. 柱子上样:

    (1) 上清和用 DNA 酶Ⅰ缓冲液加蛋白酶抑制剂平衡了的 DNA 酶Ⅰ亲和介质混合,并把介质/蛋白混合物倒到一个小杆子中。

    (2) 在装填柱子时收集流出液,通过用抗肌动蛋白抗体进行的免疫印迹、DNA 酶Ⅰ抑制分析或 SDS-PAGE 来证实有大量肌动蛋白留在柱子中。

    11. 用 2 倍体积含蛋白酶抑制剂的 DNA 酶柱缓冲液洗柱子,然后用含蛋白酶抑制剂和 0.4 mol/L NH4Cl 的 DNA 酶柱缓冲液洗柱子。

    12. 用含 50% 甲醛的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗脱肌动蛋白。

    13. 立即把 50% 甲醛洗脱液上样到 0.2~1 ml DEAE 柱子上。

    14. 用 5 倍体积的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗 DEAE 柱,然后用含 0.3 mol/L KCl 的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗脱。分部收集,每管 200 μl。

    15. 检测收集液的蛋白浓度,然后混合出峰时的收集液。

    16. 加 MgCl2 使浓度为 2 mmol/L ( 这是选用于天然肌动蛋白),以使肌动蛋白聚合,用 SDS-PAGE 分析多肽组成。

    产量应该是 5% 左右,所以从湿重 10 g 的细胞指望得到 2.5~5 mg 纯化了的肌动蛋白是合理的。


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