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    胶原酶解离组织

    发布时间: 2022-12-07  点击次数: 145次

    原理

    切碎的组织放于含有胶原酶的完-全培养基中孵育,组织分解后,通过离心去除胶原酶,高浓度接种、培养。

    材料与仪器

    胶原酶 DBSS
    培养基 移液器 皮氏平皿 培养瓶 离心管 手术刀 离心机

    步骤

    1. 将组织移人新鲜、无菌的 DBSS 中,淸洗。

    2. 转入另一培养皿(9 cm 皮氏平皿,非组织培养级別),切除多余组织,如脂肪或坏死组织。

    3. 将组织转移至第三个平皿中,用交叉的手术刀细切成大约 1 mm3 大小。

    4. 用 10~20 ml 广口移液管将组织移入 15 ml 或 25 ml 无菌离心管或常用的容器, 中(先用 DBSS 湿润移液管,否则组织块易贴壁)。

    5. 让组织块沉降。

    6. 用 DBSS 重悬清洗组织,组织块沉降后,去除上清液,重复此步骤两次以上。

    7. 将 20~30 个组织块接种于一个 25 cm2 的培养瓶中,另一瓶中接种 100~200 块。

    8. 吸净 DBSS,每瓶中加入 4.5 ml 含血清的培养基(如 DMEM/F12加10 % 胎牛血清)。

    9. 加入 0.5 ml 粗制胶原酶(2000 U/ml,Worthington CLS 或 Sigma 1A),终浓度为 200 U/ml。

    10. 于 37°C 培养 4~48 h,无需振荡。肿瘤组织(如乳腺或结肠的硬癌)由于分解较慢,可作用 5 天或更长时间。有时由于时间过长 pH 过度下降(pH<6. 5),要将组织离心并用新的培养基和胶原酶重悬。

    11. 轻轻晃动培养瓶检查分离情况:组织块呈点状分布于培养瓶底部,适当吸打后分散成单一细胞或小的组织块。

    12. 有些组织(肺、肾、结肠或乳腺癌)的部分上皮细胞小团块对胶原酶耐受,沉淀 2 min 即可与其他剩余组织分离。若将其用 DBSS 重悬,沉淀后将沉淀物接种于培养基中,将形成生长旺盛的上皮细胞岛。上皮细胞往往在未完-全解离时存活较好。

    13. 完-全分解或组织块沉降后,收集上清液中的细胞,于 50~100g 离心 3 min(离心管或常规容器,15~50 ml,依据处理组织的量而选择) 。

    14. 去除 DBSS 或培养基上清液,重悬,加入 5 ml 培养基,接种于 25 cm2 培养瓶中。若胶原酶作用时 pH 下降了(pH< 6.5 达 48 h ),去除胶原酶后用 2 倍或 3 倍培养基稀释细胞悬液。

    15. 于 48 h 后更换培养基。


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