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    口腔角质形成细胞

    发布时间: 2022-12-07  点击次数: 142次

    材料与仪器

    D-PBSA 0.17%胰蛋白酶 PET
    转运培养液 生长培养液 含抗菌素的生长培养液 手术刀和11号刀片 眼科剪 眼科镊2把 50mm或100mm培养级Petri培养皿 35mm和100mm非培养级Petri培养皿 15ml锥形离心管 微量加液器 涂有FN C BSA的50mm培养皿

    步骤

    一、原代培养

    1. 取手术切除或早期活检组织,将组织放入转运培养液(Leibowitz L-15培养液,添加 100 μg/ml 庆大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 1μg/ml     2性霉素B),尽快送到实验室。

    2. 将组织移入 100 mm 培养皿,用 P-PBSA (不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Dulbecco PBSA)浸洗。

    3. 尽量切除结缔组织和有血液部分。如果组织标本的表面面积 ≥1 cm2,将其切成小块。

    4. 将组织块放入 35 mm 培养皿,然后加入足够 0.17 % 胰蛋白酶液(用 P-PBSA 配制),覆盖组织块。在 4°C 条件下孵育过夜。

    5. 用一把镊固定组织块,用另一把镊将上皮剥离入胰蛋白酶液。

    6. 将组织悬液轻轻研磨几次,使细胞进一步分散。然后,将细胞悬液移入离心管。

    7. 用 D-PBSA 浸洗培养皿,然后将浸洗液加入细胞悬液。浸洗用量同步骤 4 组织消化的胰蛋白酶液。

    8. 用微吸管吸取一等份测定细胞产量。

    9. 在4°C 条件下离心(125 g),最好用制冷离心机。用生长培养液混悬细胞。

    10. 按要求用含抗菌索的生长培养液(生长培养液添加 100 μg/ml 庆大霉素、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 1 μg/ml   2性霉素B)稀释细胞悬液,然后将细胞接种于涂有 FN/C/BSA 的 50 mm 培养皿,密度为 5×103 个/cm2。

    11. 24 h 后换培养液,以除去细胞碎片和红细胞。

    12. 隔天换液。

    二、传代培养

    13. 用 D-PBSA 浸洗细胞。

    14. 加入 PET 液(含有 1 % 聚乙烯吡咯酮(PVP,40 KDa)、0.5 mmol/L EGTA 和 0.025 % 胰蛋白酶,用 D-PBSA 配制),完-全覆盖细胞,如在 100 mm 培养皿加入3 ml。

    15. 在室温下孵育,直至细胞变圆或从培养皿去附着。在显微镜下观察细胞去附着情况,此过程一般需要 1.5 min。可通过加入高浓度胰蛋白酶或在 37°C 条件下消化提高去附着效率。

    16. 当大多数细胞去附着时,轻弹培养皿和用胰蛋白酶液吹打细胞,以机械性地加强去附着。

    17. 细胞去附着后,向培养皿加入 5~10 ml D-PBSA,终止胰蛋白酶的消化。

    18. 将细胞悬液注入离心管,轻轻研磨,以使细胞充分混悬。

    19. 用 1 ml 吸管取细胞悬液,加入血细胞计数板,计数细胞。

    20. 计算悬液中细胞密度。

    21. 在 4°C 条件下离心(125 g,5 min)。

    22. 吸去上清液,用手指轻弹离心管,直至沉下的细胞分散。

    23. 加入适量生长培养液,用吸管轻轻混悬细胞,然后将细胞悬液注入培养皿。

    24. 将全部培养皿放入浅盘内,用手移动浅盘,并变化移动方向,从而摇动培养皿。注意保证每个培养皿中的细胞密度均匀,即摇动培养皿时集中于培养皿中心。另外,应注意将放培养皿的架平坦固定于孵育箱,孵育箱不能振动,以免细胞在贴壁过程中分布不均匀。

    25. 将细胞静置孵育 4~24 h,然后换培养液。


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