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    染色体制备

    发布时间: 2022-12-13  点击次数: 174次

    原理

    固定阻滞于分裂中期的细胞,在低渗液中膨胀,将细胞滴在载玻片上,染色,观察 [ Rothfels and Siminovitch,1958;Rooney and Czepulkowski,1986 ] 。

    材料与仪器

    D-PBS 0.25%胰蛋白酶 对数期的培养细胞 秋水仙酰胺
    低渗溶液 醋酸甲醇固定液 Giemsa染液 DPX或Permount封固剂 冰
    离心管 巴斯德吸管 载玻片 盖玻片 载玻片盒 低速离心机 涡流混悬器

    步骤

    1. 将 2× 104~ 5× 104 个细胞 /ml (4× 103~ 1× 104 个细胞 /cm2) 20 ml 在 75 cm2  的培养瓶中培养。

    2. 约 3.5 天后,细胞处于对数生长期时,将 0.2 ml 的 1×10-5 mol/L 的秋水仙酰胺(用 D-PBSA 配制)加入培养瓶内已有的培养基中,终浓度 1×10-7 mol/L 。

    3. 4~6 小时后,轻轻去掉培养基,加 5 ml 0.25% 胰蛋白酶,孵育 10 min。

    4. 在胰蛋白酶液中离心细胞,弃掉上清胰蛋白酶。

    5. 以 5 ml 低渗溶液(0.04 mol/L KCl ; 0.025 mol/L 枸橼酸钠)重新混悬细胞,37℃ 下静置 20 min 。

    6. 加入等量新鲜配制的冰冷的醋酸甲醇(一份冰醋酸加三份无水甲醇或乙醇,新鲜配置并在冰上保存),不停地混合,然后以 100 g 速度离心 2 min。

    7. 弃掉上清混合物,在涡流混悬器上震荡细胞团块,再慢慢边混勻边加新制备的醋酸甲醇。

    8. 细胞在冰上静置 10 min。

    9. 以 100 g 速度离心细胞 2 min 。

    10. 弃掉上清醋酸甲醇,以 0.2 ml 的醋酸甲醇溶液,重新振荡混悬细胞团,直到细胞均匀分散。

    11. 用吸管吸一滴细胞悬液到吸管尖部,从约 12 英寸(30 cm) 处滴到凉的玻片上,倾斜玻片,让液滴流下并铺开。

    12. 将玻片在烧杯沸水上迅速干燥,然后用相差显微镜观察。如果细胞均匀铺展而没有相互接触,则以同样浓度的细胞制备更多片子。如果细胞成堆重叠出现,则稀释悬液 2~4 倍之后,再制备一张滴液玻片。如果满意,就制备更多片子,若不满意,重复这一步骤进一步稀释。

    13. 进行 Giemsa 细胞染色:

    (a)将玻片放在架子上,架子放在水池上。

    (b)以数滴纯 Giemsa 染液完-全覆盖玻片,染色 2 min 。

    (c)以约 10 倍体积的水淹没玻片。

    (d)再静置 2 min。

    (e)用流动水冲掉稀释过的染液。

    (f) 最后用水逐张冲洗玻片去除染液沉淀。

    (g)显微镜下观察染色情况,如果满意,则将载玻片彻-底干燥,用#00盖玻片及 DPX 或 Pennoum 封片。

    注意事项

    必须倒掉染色液,因为氧化的染色液浮渣会留在玻片上。即使在平皿中染色,染液也不能倒掉,而必须用水从下向上置换掉。


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