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    小鼠肝细胞培养实验

    发布时间: 2023-01-05  点击次数: 70次

    原理

    直接从生物体内获取组织细胞进行的首-次培养称为原代细胞培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步,是从事培养工作的人员应熟悉和掌握的最基本的技术。根据培养方法不同分为组织块培养法和单层细胞培养法。

    材料与仪器

    小鼠
    DMEM DMEM 胰酶 PBS
    饭盒 纱布 小剪子 小镊子 大镊子 大烧杯 平皿 研磨玻片 滤网 离心管 6 孔培养板 吸管 移液管 手套 微量加样器

    步骤

    一、实验步骤

    1. 将小鼠断颈致死,置 75%酒精泡2-3 秒钟,取肝脏,置于盛有 PBS 的平皿中。
     
    2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有 PBS 液的平皿中。
     
    3. 用手术剪将脏器剪成小块(大小约 1mm2),玻片研磨,转到离心管,离心(1000 rpm,5 min)。
     
    4. 视组织或细胞量加额加入5-6 倍(3-5  ml)胰酶,37℃中消化 20 分钟,每隔 5 分钟振荡一次,或用吸 管吹打一次,使细胞分离。
     
    5. 加入3-5 ml 含血清的培养液以中止胰酶消化作用。
     
    6. 用100 目孔径滤网滤过,除去未消化的大组织块。
     
    7. 再次离心5 min,弃上清液。
     
    8. 加入无血清培养液5 ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
     
    9. 加入含血清的培养液 1-2 ml (视细胞量),血球计数板计数。
     
    10. 将细胞调整到5x105/ml 左右,转移至6 孔培养板中,37℃下培养。
     

    注意事项

    1. 自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。

     

    2. 在超净台中,组织细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发。

     

    3. 凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞盖住,以防止细菌落入。

     

    4. 操作前要洗手,进入超净工作台后要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭手。试剂瓶口也要擦拭。

     

    5. 点燃酒精灯,操作在火焰附近进行,耐热物品要经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间不能太长,以免退火,且冷却后才能夹取组织。吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜。

     

    6. 操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会。

     

    7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分,工作台面上的用品摆放要布局合理。

     

    8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

     

    9. 吸溶液的吸管等不能混用。


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