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    神经胶质细胞培养实验

    发布时间: 2023-01-05  点击次数: 73次

    材料与仪器

    大鼠
    CMF-Hanks液 胰蛋白酶 DMEM F12
    水浴锅 培养箱

    步骤

    一、原代培养

    1.  选用生后1周的新生大白鼠,用碘酒,酒精棉球消毒,断头取其大脑皮层组织。
     
    2.  解剖显微镜下,剥离脑膜,切除大脑髓质部分。
     
    3.  将大脑皮质在无Ca2+、Mg2+Hanks液(CMF-Hanks液)中剪碎。
     
    4.  室温下静置10 min。
     
    5.  在37℃水浴箱中用0.125%的胰蛋白酶(用CMF-Hanks液配制)消化30 min。
     
    6.  加入少许含20%血清的DMEM/F12(DMEM与F12为1:1)混合培养液(下同),用吸管稍加吹打至胰酶液与培养液混匀。离心5 min(1 000 r/min)。
     
    7.  吸去上清含酶液,重新加入含血清培养液,用吸管反复吹打至组织块消散为止。制成细胞悬液(暂称初细胞悬液)。
     
    8.  将初细胞悬液接种到玻璃瓶(或培养皿)中,于37℃、5%CO2培养箱中孵育30 min。
     
    9.  翻转培养瓶,吸出瓶中的细胞悬液。用孔径为75μm的不锈钢网过滤。
     
    10.  将滤过液离心10 min(1 000 r/min),浓缩成约3ml的细胞悬液(暂称为次细胞悬液)。
     
    11.  将次细胞悬液种植到预先涂布有多聚赖氨酸的培养瓶中。接种的细胞密度约1×104个/cm2。
     
    12.  置CO2培养箱中培养3-5h,再补加足够的培养液,继续培养9-14 h。培养液颜色略微变黄时换液。

    二、原代培养物的传代
     
    1.  吸取旧培养液用CMF-Hanks液洗涤2次。
     
    2.加入少许0.125%的胰蛋白液消化15 min。以有血清培养液终止胰酶活性。
     
    3.稍事手动摇晃,倒掉含酶液。加入有血清培养液。
     
    4.用吸管反复吹打使细胞从培养瓶壁脱落。收集细胞悬液,离心10 min(1 000 r/min)。弃上清液,给细胞沉淀物再加入培养液制成细胞悬液。
     
    5.重复原代培养时8-10步。
     
    6.将细胞悬液按0.5×105个/cm2的密度种植在经鼠尾胶原包被的培养瓶中。
     
    7.送入CO2培养箱中培养3-5 h,再加足够的培养液,继续培养。

    三、结果

    分离的大鼠大脑皮质细胞在原代培养4 h后,部分细胞即可长出细小胞突。培养3-4 d之后,细胞数量便明显增大。大鼠大脑皮质细胞原代培养一般在9-14 d,以星形胶质细胞为主的细胞即可长满培养瓶壁。


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