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    免疫荧光抗体法

    发布时间: 2023-01-05  点击次数: 55次

    原理

    用人结肠癌细胞为免疫原,免疫小鼠,制得鼠抗人结肠癌细胞表面抗原(Ag)的单克隆抗体 IgG(第一抗体),二者可以发生特异性的抗原抗体反应,形成抗原抗体复合物,再加入市售(也可自制)的荧光标记的羊抗鼠IgG抗体(第二抗体),可以与复合物进一步发生抗原抗体反应(二次抗体反应),这样就可以在光显微镜下观察到这种抗原在结肠癌细胞表面的存在。

    材料与仪器

    HeLa细胞
    1640培养液 小牛血清 甲醛固定液 PBS 液体石蜡
    盖片 载片 培养瓶 培养皿 滤纸 镊子 吸管 倒置显微镜 荧光显微镜 微量加样器

    步骤

    1.  将培养瓶中的结肠癌细胞接种到装有盖片的培养皿中,培养2~3天。

    2.  在倒置镜下观察到盖片上的细胞生长状态良好后,在盖片左上角用玻璃笔做一下标记,以免在以后的操作中正反面颠倒。

    3.  将盖片放在甲醛固定液中,4℃固定5~10分钟。

    4.  用PBS洗三次,注意不要将PBS液直接倒在盖片的细胞面,以免引起细胞大量丢失。用滤纸片将盖片上的PBS轻轻吸干,不要损伤细胞层。

    5.  将已稀释好的小鼠抗体滴在盖片上.每个盖片50 ul,37℃温育30分钟。

    6.  用PBS洗三次,滤纸吸干。

    7.  将已稀释好的荧光标记羊抗鼠二次抗体5ul滴加在盖片上,37℃温育30分钟。

    8.  用PBS洗三次,滤纸吸干。

    9.  将载片上滴一滴液体石蜡。然后将盖片细胞面朝下放到载玻片上,在荧光显微镜下观察。


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