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    小鼠胚胎MEF细胞的提取

    发布时间: 2023-01-06  点击次数: 118次

    小鼠胚胎MEF细胞的提取步骤:

    1.将新鲜收获的胚胎放入10厘米的细胞培养皿中

    2.用PBSA覆盖胚胎,取出胎盘和其他母体组织

    3.切掉头顶(眼睛及以上),取出内脏

    4.保存头部/卵黄囊进行DNA分离以进行基因分型检测

    5.将胚胎体置于单独的10厘米板中

    6.加入1mL胰蛋白酶,用刀片切碎成1mm的小碎片

    7.用酒精灯火焰对样品之间的刀片进行消毒

    8.将皿置于37°C培养箱中30-45分钟(倾斜,使胰蛋白酶覆盖细胞)

    9.通过在每口井中添加4mL MEF培养基(通常DMEM+10%FBS+1%G/A)来抑制typsin活性。

    10.用移液管10-20x吹打分离组织

    11将细胞悬浮液转移到T75烧瓶或10cm平板上,并添加6-15mL MEF培养基

    12.让细胞生长融合(3-4天)

    13.抽出培养基,用10mL PBS冲洗

    14.加入3mL胰蛋白酶,在37°C培养箱中培养5-10min

    15.加入7mL MEF培养基进行中和

    16.用移液管吸至离心管离心,使细胞重新悬浮

    17.将悬浮液转移到2个T175烧瓶中,并向每个培养瓶中添加50mL MEF培养基

    18.让细胞生长融合(3-4天)

    19通过胰蛋白酶消化收获细胞,冷冻细胞@3x106细胞/瓶,注意冷冻不能密度太稀,此细胞冻存后复苏的存活会大量减少。

     

    备注:1.在细胞培养房中执行细胞分离,并注意无菌操作,

          

    2. 建议使用含有血清的冻存液冻存。


    3. 原代分离培养请使用庆大霉素/两性霉素溶液来防止细胞污染发生。

     

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