销售热线

19126518388
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > 分离人脐静脉内皮细胞

    分离人脐静脉内皮细胞

    发布时间: 2023-01-06  点击次数: 139次

    材料与仪器

    D-PBSA 胰蛋白酶 EDTA 人脐带 胶原蛋内酶H 冷的新生小牛血
    Hank平衡盐溶液 HBSS PSG 70%乙醇 HUVRC生长培养液
    培养瓶 手术刀和22号刀片 手术针 20ml注射器 鳄鱼夹 动脉夹 尖头剪棉纸 铝箔 塑料薄膜或莎纶封皮 软木板 很坚韧的线 Luer接合管

    步骤

    内皮细胞的分离

    1. 用铝箔覆盖软木板。

    2. 将棉纸铺在铝箔上面,然后用 70 % 乙醇浸泡。

    3. 挤出脐带中的血液。

    4. 切除脐带一端 2 cm 或 2 cm 以上,包括动脉夹痕迹处。

    5. 将 Luer 接合管外套插入静脉。

    6. 用针将脐带钉在软木板上,但注意勿穿经血管腔。

    7. 用手术刀和手术镊剥出一段静脉,长约 2 cm。

    8. 缝线固定接合管,紧紧打结两次。

    9. 夹闭脐带另一端,将 20 ml 注射器接在接合管上,再将 25 ml D-PBSA (放在冰上)注入脐带。靠 D-PBSA 的压力将静脉扩张。检査脐带是否有小孔。如有小孔,用鳄鱼夹夹持脐带,使小孔闭合,但不要夹闭静脉。

    10. 将 D-PBSA 自脐带排人废液瓶。

    11. 切除脐带另一端,插入接合管,如步骤 8 缝线固定。

    12. 用另一只注射器将 25 ml 胶原蛋白酶液(胶原蛋内酶 H:是从溶组织梭状芽孢杆菌提纯的(1074059,Roche)。0.5 mg/ml, 用 M199 配制 25 ml)注入脐带,直至脐带膨胀。

    13. 用乙醇喷过的塑料薄膜将脐带包裹,在 37°C 条件下放置 8 min。

    14. 将胶原蛋白酶液挤出脐带,同时回抽注射器。

    15. 拔出注射器,将胶原蛋白酶液注入含有 5 ml NBS(冷的新生小牛血清,5 ml) 的试管。

    16. 在脐带另一端换注射器,将 25 ml D-PBSA 注入脐带。

    17. 挤压或拍打整段脐带一会儿,然后用此端的注射器抽取 D-PBSA。

    18. 将抽取的 D-PBSA 注入在步骤 15 使用的试管。

    19. 在 4°C  条件下离心(210 g,10 min)。

    20. 用 5 ml HUVFC 生长培养液混悬细胞。

    21. 吸去培养瓶内多余的明胶溶液,接种细胞。

    22. 第 2 天从培养瓶吸去培养液。

    23. 用 D-PBSA 洗两次,然后加入 HUVEC 生长培养液(M 199 培养液,添加 Hank 盐、2 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、20% FBS、150 U/ml 青霉素和链霉素混合液以及从牛脑提纯的内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement,ECGS)。使用 Roche 公司生产的 EGGS (1033484,75 mg)时,25 μg/ml,并用 5 μg/ml 肝素,也可使用 Sigma 公司的产品(E2759,15 mg),30 μg/ml,并用 10 μg/ml 肝素)。

    维持培养

    24. 吸去一半培养液,加入新鲜培养液,每周 3 次。

    25. 大约每周传代一次。将胰蛋白酶和 EDTA 混合液加入培养瓶,收集细胞,然后按 1 : 2 传代。

    26. 不要使用超过 6 代的细胞。


在线咨询
咨询热线

0759-5588931

[关闭]