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    PEG 介导的鸡血细胞融合

    发布时间: 2023-01-12  点击次数: 60次

    简介

    细胞融合的方法有生物法、化学法和物理法。化学法常用的是化学诱导剂聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)结合高 pH、高钙离子法。该法操作方便,目前已成为人工诱导细胞融合的主要手段。

    原理

    PEG 介导的细胞融合的基本原理是利用 PEG 使细胞相互接触部位的膜结构发生重排,加之膜脂双层的相互亲和以及彼此间表面张力的作用,引起相邻质膜在修复时相互合并在一起,导致细胞之间发生融合。PEG 介导的细胞融合率受下述因素影响。


    ① PEG 的分子量与浓度:分子量及其浓度与融合率成正比;但分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者,常用的 PEG 相对分子质量为 1000~4000,浓度为 40%~60%。


    ② PEG 的 pH 值:pH 值在 8.0~8.2 之间融合效-率-最-高。


    ③ 融合时的温度:由于生物膜的流动性与温度成正比,在细胞可承受的温度范围内适当提高温度,可提高融合率。


    ④ 处理时间:处理时间越长,融合率越高,但对细胞的毒害也越大。故一般将处理时间限制在 1.0~1.5 min 之内。若融合后不继续培养,可将处理时间延长至 20 min。

    用途

    细胞融合不仅可用于核质关系、基因定位、体细胞的遗传和发育等生物学的基础理论研究,而且在生产实践上还有重要的应用价值,目前已成功应用于单克隆抗体的制备、新品种的培养、性状的改良、疾病的治疗和潜伏病毒的研究等领域。

    材料与仪器

    器材:


    ① 天平


    ② 普通低速离心机


    ③ 恒温水浴锅


    ④ 普通光学显微镜


    ⑤ 滴管、5 ml 刻度离心管、盖玻片、载玻片、一次性注射器、烧杯、血细胞计数板

    试剂:


    ① 材料:健康成年鸡


    ② 肝素钠


    ③ Alsever 溶液


    ④ 0.85% 生理盐水


    ⑤ GKN 溶液


    ⑥ PEG(M,=4000)(50%)


    ⑦ 詹纳斯绿(Janus green)染液

    步骤

    PEG 介导的鸡血细胞融合的基本过程可分为如下几步:


    (一)试剂配制


    (1)Alsever 溶液


    葡萄糖 2.05 g,柠檬酸钠 0.80 g,NaCl 0.42 g,溶于双蒸水中,定容至 100 ml。


    (2)GKN 溶液


    NaCl 8 g, KCl 0.40 g, Na2HPO4 · 12H2O 3.77 g, NaH2PO4 · 2H2O 0.78 g,葡萄糖 2 g,酚红(phenol red)0.01 g,溶于双蒸水中,定容至 1000 ml。


    (3)詹纳斯绿染液


    称取 30 mg 詹纳斯绿染料,溶于 100 ml 生理盐水中,混匀,即可得到 0.03% 的染液。


    (4)50% PEG 溶液


    称取 10 g PEG,151bf/in2(103.4 kPa)高压灭菌 20 min,待冷却至 50~60 ℃ 时加入 10 ml 温热的 GKN 溶液并混匀。如配制过程中 PEG 发生凝固,重新加热使其熔化。用 NaHCO3 调 pH 至 8.0。4 ℃ 保存备用,临用前置 37 ℃ 预温。最好现用现配。

    (二)细胞融合


    (1)将新鲜的鸡血直接注入加有一支肝素钠的烧杯中,混匀抗凝。


    (2)用量筒量取一定量的上述抗凝鸡血,加入 Alsever 溶液,配制成 1:4 细胞悬液备用或 4 ℃ 冰箱保存(3~4 d 内可用)。


    (3)用 1 只 5 ml 刻度离心管取 0.5~1 ml 上述鸡血悬液,加入 0.85% 生理盐水至 5 ml,混匀平衡后,800 g 离心 5 min,弃上清液。再按上述条件重复离心 2 次。最后,弃上清液,加 GKN 溶液至 5 ml,800 g 离心 5 min。


    (4)弃上清液,加适量 GKN 溶液,吸管吹打混匀,制成 10% 细胞悬液。


    (5)取以上悬液以血细胞计数器计数,若细胞密度过大,用 GKN 溶液稀释至(3~4)x107 个/ml(此步也可省略)。


    (6)取以上细胞悬液 1 ml 于离心管,或在原离心管中弃去一部分悬液,保留 1 ml 于原离心管中。将离心管放入 37 ℃(39 ℃ 更佳)水浴锅中预热。


    (7)待温度恒定后,向上述 1 ml 细胞悬液中缓慢逐滴加入 0.5 ml 预热的 50% PEG 溶液(慢慢沿离心管壁流下融合剂),且边加边轻播离心管混匀,最后用吸管轻轻吹打混匀。放入水浴锅中静置孵育。


    (8)细胞融合一段时间(10~20 min)后,加入 GKN 溶液至 5 ml,静置于水浴锅中继续孵育 20 min 左右。


    (9)取出离心管,800 g 离心 5 min,使细胞完-全沉降。弃上清液,加 GKN 溶液至 5 ml,重悬沉淀,重复离心 1 次。


    (10)弃上清液,加入少量(0.5 ml 左右)GKN 溶液,混匀,取少量悬液于载玻片加入詹纳斯绿染液,用牙签搅匀,染色 5 min(也可用吉姆萨染液染色 5~10 min)。盖上盖玻片,观察细胞融合情况并计算融合率。鸡血

    注意事项

    (1)滴加 50% PEG 时,应缓慢、逐滴加入,其间最好轻弹试管底部,滴加完毕后用滴管充分温和混匀。


    (2)镜检观察时要注意区分融合细胞与重叠细胞。


    (3)在实验中统计融合率时,要进行多个视野计数,然后进行平均,以使统计更为准确。


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