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    砷钼酸比色法

    发布时间: 2023-01-16  点击次数: 63次

    原理

    还原糖是具有羰基(>C=O)的糖,能将其它物质还原而其本身被氧化。

    (1) 还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热,可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子,产生砖红色的氧化亚铜沉淀,其本身被氧化。具体反应如下:


    (2)氧化亚铜在酸性条件下,可将钼酸铵还原,还原型的钼酸铵再与砷-酸氢二钠起作用,生成一种蓝色复合砷钼蓝,其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量(即被还原的Cu2O 量)成正比,用标准葡萄糖与砷钼酸作用,比色后做标准,就可测得样品还原糖含量。

    材料与仪器

    植物材料
    铜试剂 砷钼酸试剂 标准葡萄糖原液
    分光光度计 具塞刻度试管 水浴锅 刻度吸管 容量瓶 漏斗 研钵

    步骤

    1.标准曲线的制作:


    在一系列刻度试管中,分别加入200μg/mL 标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL,再顺序加入蒸馏水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 及1.4 mL,配成浓度分别为0、10、20、30、40、50 及60μg/mL 的系列葡萄糖溶液。每试管加入铜试剂2mL,混匀后沸水浴中加热10min,立即冷却,再加入2mL 砷钼酸试剂,振荡两分钟后稀释到20mL,用分光光度计在620nm 波长下比色,测其光密度OD620nm(做一式两份)。以糖浓度微克数为横坐标,光密度OD620nm 为纵坐标,绘制标准曲线。


    2.植物样品中还原糖的提取:


    将样品洗净,吸干其表面水分,切碎混匀,称取1g 放入研钵中,加入约0.5g 石英砂,磨成匀浆,加水将样品由玻璃漏斗冲入100mL 容量瓶中,加水达70-80mL,摇匀后置于80℃恒温水浴上浸提0.5h。


    待上述样品冷却后,沉淀蛋白质,加入5%硫酸锌5mL,再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL,以沉淀蛋白质。振荡后静置,至上层出现清液后再加一滴Ba(OH)2,直至无白色沉淀时,向容量瓶加水至刻度。


    3.还原糖含量的测定:


    过滤上述已定容的样品液,取5mL 滤液,再定容到100mL(此步视样品的含糖量而定)。取已稀释的溶液2mL,与标准葡萄糖显色法相同:加铜试剂2mL,煮沸10min,加砷钼酸试剂2mL,振荡2mL,定容到15ml,620nm 波长下比色,记下光密度OD620nm(至少重复两次)。

    注意事项

    比色皿的外面应被擦干净。

    常见问题

    OD是当光经过一个样本时,部分光会被吸收。在光谱学,透光率是出射光和入射光强度的比。


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