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    淀粉酶活性的测定

    发布时间: 2023-01-30  点击次数: 596次

    原理

    α-淀粉酶及β-淀粉酶,各有其一定的特性,如β-淀粉酶不耐热,在高温下易钝化而α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下则发生钝化,通常提取液同时有两种淀粉酶存在,测定时,可根据它们的特性分别加以处理,钝化其中之一,即可测出另一酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β-淀粉酶,便可测定α-淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以处理,钝化α-淀粉酶的活性,以测出β-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖,可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团,在一定范围内其颜色的深浅与糖的深度成正比,故可求出麦芽糖的含量,以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。

    材料与仪器

    步骤

    一、 实验材料仪器及试剂

    1、实验材料:萌发的小麦(芽长1厘米左右)

    2、仪器:(1)小台秤;(2)研钵;(3)容量瓶:100毫升×1;(4)具塞刻度试管25毫升×13;(5) 试管:8支;(6)刻度吸管:1毫升×2,2毫升×2;(7)离心机;(8) 恒温水浴; (9)分光光度计。

    3、试剂:

    (1)1%淀粉溶液;

    (2)0.4 N NaOH;

    (3)pH5.6的柠檬酸缓冲液:A、称取柠檬酸20.01克,溶解后稀释至1升;B、称取柠檬酸钠29.41克,溶解后稀释至1升。取A液13.7毫升与B液26.3毫升混匀,即为pH5.6之缓冲液。

    (4)3,5-二硝基水杨酸:精确称取3,5-二硝基水杨酸1克溶于20毫升1N氢氧化钠中,加入50毫升蒸馏水,再加入30克酒石酸钠,待溶解后,用蒸馏水稀释至100毫升,盖紧瓶塞,勿使二氧化碳进入。

    (5)麦芽糖标准液:称取麦芽糖0.100克溶于少量蒸馏水中,仔细移入100毫升容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度。

    二、操作步骤:

    1、酶液的提取:

    称取2克萌发的小麦种子(芽长1厘米左右),至研钵中加一克石英砂,磨成匀浆倒入25毫升具塞刻度试管中,用蒸馏水稀释至刻度,混匀后在室温(20℃)下放置,每隔数分钟震荡一次,放置15-20分钟,离心,取上清液备用。

    2、α-淀粉酶活性的测定:

    (1)取试管4支,注明两支为测定管。

    (2)于每管中各加酶提取液1毫升,在70℃恒温水浴中(水温度的变化不应超过±0.5℃)准确加热15分钟,在此期间β-淀粉酶受热而钝化,取出后迅速在自来水中冷却。

    (3)在试管中各加入1毫升pH5.6柠檬酸缓冲液。

    (4)向对照管中加入4毫升0.4N氢氧化钠,以钝化酶的活性。

    (5)将测定管和对照管置40℃(±0.5℃)恒温水浴中保温15分钟,再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2毫升,摇匀,立即放入40℃水浴中准确保温5分钟后取出,向各测定管迅速加入4毫升0.4N氢氧化钠,以终止酶的活动,然后准备下步糖的测定。

    3、α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定:

    取上述酶液2-6毫升,放入容量瓶中,用蒸馏水稀释至100毫升(稀释程度视酶活性大小而定)混合均匀后,取4支试管,各加入稀释之酶液1毫升及1毫升pH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶的第(4)及(5)的操作,同样准备糖的测定。

    4、麦芽糖的测定:

    (1)取25毫升刻度试管7个,编号,分别加入麦芽糖标准液(1毫克/毫升)0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升,置沸水浴中准确煮沸5分钟,取出冷却,用蒸馏水稀释至25毫升,用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录消光值,以消光值为纵坐标,以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。

    (2)样品的测定:取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2毫升,分别放入25毫升具塞刻度试管中,再加入2毫升3,5-二硝基水杨酸试剂,混匀,置沸水中准确煮沸5分钟,取出冷却,用蒸馏水稀释至25毫升,混匀。用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录消光值,从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量,然后进行结果计算。

    注意事项


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