淀粉酶活性的测定

α-淀粉酶及β-淀粉酶，各有其一定的特性，如β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化，通常提取液同时有两种淀粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β-淀粉酶，便可测定α-淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以处理，钝化α-淀粉酶的活性，以测出β-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5-二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的深度成正比，故可求出麦芽糖的含量，以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。

一、 实验材料仪器及试剂

1、实验材料：萌发的小麦（芽长1厘米左右）

2、仪器：（1）小台秤；（2）研钵；（3）容量瓶：100毫升×1；（4）具塞刻度试管25毫升×13；（5） 试管：8支；（6）刻度吸管：1毫升×2，2毫升×2；（7）离心机；（8） 恒温水浴； （9）分光光度计。

3、试剂：

（1）1%淀粉溶液；

（2）0.4 N NaOH；

（3）pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01克，溶解后稀释至1升；B、称取柠檬酸钠29.41克，溶解后稀释至1升。取A液13.7毫升与B液26.3毫升混匀，即为pH5.6之缓冲液。

（4）3,5-二硝基水杨酸：精确称取3,5-二硝基水杨酸1克溶于20毫升1N氢氧化钠中，加入50毫升蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100毫升，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。

（5）麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100克溶于少量蒸馏水中，仔细移入100毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。

二、操作步骤：

1、酶液的提取：

称取2克萌发的小麦种子（芽长1厘米左右），至研钵中加一克石英砂，磨成匀浆倒入25毫升具塞刻度试管中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀后在室温（20℃）下放置，每隔数分钟震荡一次，放置15-20分钟，离心，取上清液备用。

2、α-淀粉酶活性的测定：

（1）取试管4支，注明两支为测定管。

（2）于每管中各加酶提取液1毫升，在70℃恒温水浴中（水温度的变化不应超过±0.5℃）准确加热15分钟，在此期间β-淀粉酶受热而钝化，取出后迅速在自来水中冷却。

（3）在试管中各加入1毫升pH5.6柠檬酸缓冲液。

（4）向对照管中加入4毫升0.4N氢氧化钠，以钝化酶的活性。

（5）将测定管和对照管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15分钟，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2毫升，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5分钟后取出，向各测定管迅速加入4毫升0.4N氢氧化钠，以终止酶的活动，然后准备下步糖的测定。

3、α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定：

取上述酶液2-6毫升，放入容量瓶中，用蒸馏水稀释至100毫升（稀释程度视酶活性大小而定）混合均匀后，取4支试管，各加入稀释之酶液1毫升及1毫升pH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶的第（4）及（5）的操作，同样准备糖的测定。

4、麦芽糖的测定：

（1）取25毫升刻度试管7个，编号，分别加入麦芽糖标准液（1毫克/毫升）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升，置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。

（2）样品的测定：取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2毫升，分别放入25毫升具塞刻度试管中，再加入2毫升3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀，置沸水中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，混匀。用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，然后进行结果计算。