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    H1人胚胎干细胞的培养

    发布时间: 2023-02-24  点击次数: 589次

    H1人胚胎干细胞的培养

    1.试剂和材料

    H1细胞专用培养基试剂

    成分

    规格

    数量

    储存条件

    H1细胞基础培养基

    500mL

    1瓶

    2-8℃

    H1细胞培养基添加剂

    20mL

    1支

    -20℃

    所需的其它试剂和材料

    产品

    规格

    货号



    Y27632

    1mg

    H1Med-iCell-CA005



    Matrigel

    5mL

    H1Med-iCell-CA004



    H1细胞消化液

    500mL

    H1Med-iCell-CA003



    ES细胞专用冻存液

    100mL

    iCell-0700-T



    另需细胞培养皿/瓶/板,15mL离心管和移液管等细胞培养耗材

    2.培养流程

    2.1试剂的制备

    2.1.1 培养基的制备

    2.1.1在室温(15-25℃)或冰箱内(2-8℃)过夜解冻细胞培养基添加剂,可在无菌条件下将添加剂分装为适量的工作等份,并在-20℃下冻存。冷冻的分量须在3个月内用完。解冻后的分量应该一天内制备成专用培养基。请勿在解冻后再次冷冻。

    2.1.2.在无菌条件下将20mL的添加剂全部解冻后加入到500mL的基础培养基中,充分混匀。专用培养基在(2-8℃)下储存时刻维持稳定状态最多2-3周,或在-20℃下冷冻时刻维持稳定状态最多3个月。在室温(15-25℃)或冰箱内(2-8℃)过夜解冻冷冻的培养基,不要长时间放在37℃水浴内加热培养基。

    如果在无菌条件下制备,细胞专用培养基可直接使用。

    2.1.2 Matrigel工作液的配制与包被

    鉴于基质胶的操作环境要求比较严格,为保证您的实验顺利,特此对以下几个方面进行温馨提示:

    1. 收货时,首先确认还有干冰,Matrigel成固态,液面水平,如有异常请及时拍照取证并联系我们。

    2. 整个Matrigel只能分装一次,在分装前,要先放4℃冰箱(最好先把Matrigel插在冰上,然后放入4℃冰箱)过夜,且分装用的枪头、EP管等都要提前-20℃预冷(基质胶在10℃以上会发成胶凝固导致基质胶报废),整个分装过程都需在冰上进行,且以后每次试验时拿出本次用量所需的基质胶。

    3. 实验人员手心不要接触基质胶,如:要手持装有Matrigel的EP管的上方,防止体温使基质胶成胶凝固。 

    4. Matrigel的稀释比例建议为100倍稀释。

    本库建议的配制Matrigel工作液方法:

    1. 稀释前将Matrigel放入4℃冰箱过夜融化。

    2. 将适量体积的稀释液(DMEM/F12或PBS)置4℃冰箱预冷。

    3. 将融化的Matrigel与稀释液从冰箱中取出并打开盖子,用移液管吹吸稀释液几次以冷却移液管,并吸取少量稀释液加入Matrigel管中混匀,将Matrigel转移到稀释液中,并吹打混匀。(因为Matrigel遇15℃以上温度就会成凝胶粘在原装玻璃壁和移液管壁上,故Matrigel从冰箱拿出来以后尽快打开盖子并转移到预冷的稀释液中,吸取Matrigel的移液管一定要冷却)。

    4. 立即用稀释后的Matrigel包被培养板或培养皿。对于6孔板,每个孔使用1mL稀释后的Matrigel,对于6cm的培养皿,每个孔使用2mL稀释后的Matrigel,晃动培养板使Matrigel溶液均匀的分布在表面上。

    5. 使用前,包被的培养板应放在培养箱(37℃)下至少1h。请勿让培养板脱水。在培养板可供使用之前,请勿移除Matrigel溶液。

    如果不立即使用,培养板必须密封,以防止脱水。包被后的培养板可在2-8℃下最多储存7天。

    如果Matrigel溶液并未全覆盖表面,则无法实验最佳的细胞培养,因此,不建议使用含有溶液已蒸发区域的培养板。

    如果已将培养板在2-8℃下储存,则在移除Matrigel溶液之前,将培养板在培养箱(37℃)下放置30min。

    2.1.3 Y27632的配制

    Y27632粉末溶解在PBS中,配制成浓度未10mM的储存液,0.22μm滤膜过滤除菌。分装后冷冻于-20℃。

    Y27632提高复苏和传代后的克隆形成率,所以只在复苏和传代步骤添加(1:1000,即终浓度为10μM),换液时不添加。

    2.2.复苏

    在开始复苏前,将所有试管、预热后的培养基和培养皿准备好,已确保尽快完成复苏过程。

    1. 将冻存管从液氮中取出,快速在37℃水浴槽中解冻,轻柔持续地摇动冻存管,直到只剩下一个小冷冻团。从水浴槽取出冻存管,70%乙醇擦拭进行消毒。

    2. 使用移液管将冻存管中含有H1细胞的冻存液轻轻转移至一个含有5-6mL已经预热的专用培养基的15mL离心管中,过程必须轻柔防止吹散细胞团。

    3. 室温300g离心5min。

    4. 吸出培养基,确保细胞团完整。

    5. 然后缓慢加入1mL专用培养基,用手指轻弹离心管底部,使细胞团脱离底部并分散。

    6. 轻轻的将此1mL细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶,根据最终培养细胞的液体体积,加入ROCK inhibitor Y27632,终浓度为10μM。

    7. 将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中,每天更换培养基(换液不需要再添加Y27632,但培养基需提前预热)

    2.3.传代

    当集落变得较大、中心变得密集、明亮(对比边缘),相邻的集落开始融合时,此时可进行传代。

    1. 传代前,准备 37 ℃预热好的无钙镁 PBS 溶液及消化液,专用培养基。

    2. 吸走上清,并加入 37℃预热好的 PBS 溶液清洗1次。

    3. 加入适量(按 6 孔板每孔加 1mL,6cm 皿加 2mL,10cm 皿加 3mL 的量)的 37℃预热好的消化液。

    4. 37℃放置1-2min,用手指轻弹皿/板/瓶身,显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底,克隆内部大部分细胞成团脱落。

    5. 加入适量的专用培养基终止消化。

    6. 移入离心管,300g离心5min。

    7. 离心后重悬(重悬步骤参照复苏4-5步)。

    8. 传代比例为 1:6—1:8,根据最终培养细胞的液体体积,加入ROCK inhibitor Y27632,终浓度为10μM。

    9. 将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中,每天更换培养基(换液不需要再添加Y27632,但培养基需提前预热)。

    2.4.冻存

    当集落变得较大、中心变得密集、明亮(对比边缘),相邻的集落开始融合时,此时可进行传代。

    1. 传代前,准备 37 ℃预热好的无钙镁 PBS 溶液及消化液,专用培养基。

    2. 吸走上清,并加入 37℃预热好的 PBS 溶液清洗1次。

    3. 加入适量(按 6 孔板每孔加 1mL,6cm 皿加 2mL,10cm 皿加 3mL 的量)的 37℃预热好的消化液。

    4. 37℃放置1-2min,用手指轻弹皿/板/瓶身,显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底,克隆内部大部分细胞成团脱落。

    5. 加入适量的专用培养基终止消化。

    6. 移入离心管,300g离心5min。

    7. 离心后重悬(重悬步骤参照复苏4-5步)。

    8. 使用预冷的冻存液轻轻的重悬细胞团,然后将细胞悬液转移至冻存管,冻存按 6 孔板每孔冻 1 支,6cm 皿冻 2-4 支,10cm 皿冻 6-12 支。


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