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    免疫组织化染色

    发布时间: 2023-04-10  点击次数: 593次

    材料与仪器

    新鲜组织
    二甲苯 酒精 H2O2 抗原修复液 枸橼酸钠缓冲液 石蜡 福尔马林 PBS DAB 苏木素 树胶 丙酮 打孔液 柠檬酸钠 APES
    恒温摇床 高压锅 塑料切片架 耐温玻璃容器 -80℃冰箱 恒冷冰冻切片机 载玻片

    步骤

    一.石蜡切片免疫组化染色实验步骤:
    1.石蜡切片脱蜡至水:(石蜡切片染色前应置60℃ 1 小时)。
    (1)二甲苯I、II,各10 分钟。
    (2)梯度酒精:100%,2 分钟® 95%,2 分钟® 80%,2 分钟® 70%2 分钟。
    (3)蒸馏水洗:5 分钟,2 次(置于摇床)。
    2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2,室温10 分钟(避光)。
    3.蒸馏水洗:5 分钟,2 次(置于摇床)。
    4.抗原修复:
    根据待检测的抗原,选择适当的方法。
    附:抗原修复液(10mM pH 6.0 枸橼酸钠缓冲液)的配制
    (1)储备液的配制:
    A 液:枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml
    B 液:枸橼酸21g + 蒸馏水1000ml
    (2)工作液的配制:A 液82ml + B 液18ml + 蒸馏水900ml
    抗原修复的方法:
    (1)高压锅处理技术:枸橼酸钠缓冲液(10mM,PH6.0),淹没切片,盖上锅盖,高压锅内煮沸,上汽3 分钟后缓慢冷却(可用自来水在高压锅外冲,以助冷却)。
    (2)微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内,枸橼酸钠缓冲液淹没切片,选择中高或高档,5 分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液;再选择中高或高档,5 分钟(. 最佳温度为92~95℃)
    (3)酶消化处理:此略。
    抗原修复的注意事项:
    (1)组织不能干。
    (2)选择抗原修复方法要因抗体而异。
    (3)该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
    (4)抗原修复后至DAB 显色的过程中,均需用PBS 缓冲液。
    5.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床)。

    6.正常血清封闭:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态),滴加正常山羊或兔血清(与第二抗体同源动物血清)处理,37℃,15 分钟。


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