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    大鼠胰腺移植模型制作

    发布时间: 2023-04-11  点击次数: 503次

    原理

    成功的胰腺移植能为糖尿病患者或试验对象提供具有正常功能的胰腺组织,能生理性调节胰岛素的分泌,维持正常血糖,阻止甚至逆转糖尿病并发症的发生、进展。目前建立的模型多是供胰的静脉回流采用供体门静脉与受体下腔静脉端侧吻合的体循环回流方式。

    材料与仪器

    供、受者大鼠
    链脲霉素 10%的四氧嘧啶 葡萄糖生理盐水 1%的戊吧比妥钠 乙-醚 25U L肝素溶液 无菌水
    显微外科手术器械包 手术显微镜 眼科剪 手术器械

    步骤

    一、供、受者大鼠的选择


    根据不同的研究目的选择不同的动物品系,在同种移植模型中,一般采用两种纯系健康大鼠,如Lewis大鼠,Brown Norway 大鼠(BN),DA大鼠等,国内应用Wistar,SD大鼠也比较多。其中受者大鼠于移植手术前制备成糖尿病模型。


    二、大鼠糖尿病模型的建立


    1. 方法一:10%的四氧嘧啶按100mg/kg的剂量连续两天于大鼠腹股沟区皮下注射,隔日测定血糖,一周后血糖持续>16.7mmol/L者,作为合格的糖尿病受者大鼠。


    2. 方法二:采用70mg/kg肌肉注射链脲霉素,以尿糖定性强阳性,非禁食血糖>20mmol/L持续10天者为稳定的糖尿病模型。


    3. 方法三:受者鼠一次性静脉注射链脲霉素55mg/kg,第7d开始测定非禁食血糖,若血糖浓度连续3d超过22mmol/L,判定为大鼠糖尿病诱导成功。


    三、术前准备及麻醉方式


    术前供者禁食24h,饮用50g/L葡萄糖生理盐水,受者禁食24h,饮用25g/L葡萄糖生理盐水,供、受者麻醉均采用1%的戊吧比妥钠40mg/kg腹腔注射,麻醉过浅时加乙-醚吸入辅助。


    四、供胰切取术


    1. 麻醉成功后,经腹正中切口进腹。


    2. 将胃向上翻起,结扎切断胰腺和大网膜之间的血管联系及胃网膜左右动静脉,结扎十二指肠近端,切断幽门,在食管与胃交界出结扎切断胃左血管、食管,结扎切断胃短动脉并切除全胃。


    3. 胰腺下缘自脾脏向胰头方向游离胰腺,保留胰管入十二指肠管约1.5cm,结扎切断肠系膜上血管。


    4. 结扎切断胆总管及肝固有动脉,游离门静脉至入肝门分叉处。


    5.打开腹主动脉前被覆的后腹膜,结扎切断左右肾及肾上腺动脉,全部游离腹腔动脉和肠系膜上动脉所在的腹主动脉段,经阴茎背静脉注入肝素(25U/L)生理盐水。


    6. 分别结扎肠系膜上动脉开口以下和腹腔动脉开口以上的腹主动脉,肠系膜上动脉开口以下腹主动脉插管,予以4℃ Euro Collins液(或者4℃平衡液25U/L肝素溶液)灌洗移植物,同时横断门静脉,灌洗至门静脉断端流出液转清,移植物颜色由淡红变为苍白。


    7. 灌洗完成后,完整地切取移植物及脾脏,移植物置4℃Euro Collins液中保存。


    五、供胰植入术


    1. 腔静脉-膀胱引流式胰腺移植


    (1)下腹正中切口进腹,用生理盐水纱布将肠管推向上方,膀胱、精囊腺推向下方并以拉钩固定,游离髂血管分叉上方1.5cm左右的腹主动脉及下腔静脉,经阴茎背静脉注射肝素(25IU/L)至全身肝素化。


    (2)血管夹阻断游离血管上下端,9-0无创显微缝线作供者门静脉与受者下腔静脉连续端-侧吻合,8-0无创显微缝线作供者腹主动脉与受者腹主动脉连续端-侧吻合。吻合过程中移动胰腺时,牵动与移植胰腺相连脾脏,避免直接钳夹移植胰。吻合口及供者腹主动脉表面可以涂少量的ZT胶,以封闭吻合口缝隙和腹主动脉营养血管,切除移植物附带的脾脏,先远心端再近心端松开血管夹,恢复移植胰血供。


    (3)将供者十二指肠段与受者膀胱顶部行侧-侧吻合(3-0丝线单层连续缝合),吻合口大约0.5cm,大网膜覆盖移植物,关腹结束手术。


    2. 门静脉-肠道引流式胰腺移植


    (1)腹正中切口入腹,打开腹腔,在左肾静脉以下,分离出腹主动脉,用改良过的李氏钳纵行夹住该段动脉,纵行切开动脉闭,用含肝素的平衡盐溶液冲洗管腔,在低位分离肠系膜上静脉,近端用微血管夹夹住,远端用3-0丝线结扎,在同一水平高度同时结扎肠系膜上动脉。


    (2)紧靠丝线结扎处切断肠系膜上静脉,管腔同样用含肝素的平衡盐溶液冲洗,切断缺血的小肠及回盲部(30——40%),用7-0尼龙线将两断端行端-端全层肠吻合,将移植物从冰水中移出,用带冰屑的湿纱布覆盖移植物。


    (3)先行静脉缝合,应确保静脉吻合后无扭转,供者门静脉与受者肠系膜上静脉以10-0无损伤显微缝线端-端间断缝合,在缝合过程中,用生理盐水灌洗静脉腔,并轻轻地用显微钳分离血管边缘,避免吻合口狭窄。供胰腺的腹主动脉与受者的腹主动脉以9-0无损伤显微缝合线行端-侧连续缝合。


    (4)吻合完毕后先松开静脉夹,再松开动脉夹,用干明胶海绵轻压动脉吻合口1——2min。


    (5)最后,供胰的十二指肠开口一端与受者近端空肠行端-侧吻合,另一端结扎。切除供胰上附着的脾脏,关腹结束手术。


    六、术后监测和处理


    根据实验研究设计的需要监测移植胰功能,如果移植胰功能正常,在发生排斥反应以前空腹血糖值正常,C-肽值正常。


    注意事项

    1. 术后注意受者动物保温,可以置于电热毯上,以电灯热辐射24h。一般情况下,动物于术后1h内从麻醉中苏醒。


    2. 术后每天皮下注射含25g/L葡萄糖和4.5g/L氯化钠的糖盐水30——40ml(内含150mg氧哌溱青霉素),36—48h视动物情况开始正常饮食。


    常见问题

    1. 手术顺利的大鼠一般在麻醉清醒后即可正常活动,对外界刺激反应灵敏。在血糖恢复正常后,大鼠的毛色变得有光泽,体重逐渐增加。手术不成功的大鼠则表现为毛发凌乱且色泽暗淡,后背拱起,活动少,对外界刺激反应性差。


    2.在正式建模实验前,*行显微外科基本功练习并进行预实验4多次,目的在于进一步熟练显微外科技术、摸索最佳手术方式与手术条件。在手术方案成熟以后进行正式实验。

    3.来源论文《大鼠胰腺移植模型的建立及趋化因子在移植排斥反应中作用的实验研究》。


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