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    PCR 操作中必知的 6 大细节

    发布时间: 2023-05-05  点击次数: 678次

    1、最好使用一次性进口 tip 头,以避免液体残留;同时,tip 头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染。

    2、加样时,tip 头要伸入 PCR 反应管的液面下一点,然后将液体缓缓打入液面下,至恰好打出一个小气泡为至;加样过程最好在冰块上操作;移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性,而导致加样量的不准确。

    3、配制反应体系时,若反应物为冻结制品,需在融解后上下颠倒轻轻均匀混合;加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均;按照液体体积由大到小的顺序将反应物加入到 PCR 管中;引物和模板和体系所加的比例要合适,模板过量反而会抑制体系的反应。

    4、 操作多份样品时,可先制备反应混合液,即将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好后分装,这样即可避免污染,又可增加反应的精确度。

    5、避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心;PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内,有些最好于当日电泳检测,大于 48h 后带型不规则甚至消失。

    6、如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。


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