PCR 操作中必知的 6 大细节

1、最好使用一次性进口 tip 头，以避免液体残留；同时，tip 头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。

2、加样时，tip 头要伸入 PCR 反应管的液面下一点，然后将液体缓缓打入液面下，至恰好打出一个小气泡为至；加样过程最好在冰块上操作；移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性，而导致加样量的不准确。

3、配制反应体系时，若反应物为冻结制品，需在融解后上下颠倒轻轻均匀混合；加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均；按照液体体积由大到小的顺序将反应物加入到 PCR 管中；引物和模板和体系所加的比例要合适，模板过量反而会抑制体系的反应。

4、 操作多份样品时，可先制备反应混合液，即将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好后分装，这样即可避免污染，又可增加反应的精确度。

5、避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心；PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚至消失。

6、如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

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