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    PCR 引物设计

    发布时间: 2023-05-05  点击次数: 752次

    好的引物会让 PCR 实验成功一半,因而,引物设计一直都是 PCR 非常重要的环节。经典之法就是让 Premier5 携手 oligo,共同设计 PCR 引物。

    1、以小鼠的 IL-17 为例,进入 NCBI 界面,选择 Nucleotide 后,输入 IL-17,点击 search。然后选择人类 IL-17 的 mRNA,在 CDS 选项中,找到编码区所在位置,在下面的 origin 中,
    选定目的序列。

    2、打开 Primer Premier5 软件,点击菜单栏 File|New|DNA Sequence,在出现的对话框里黏贴目的序列,并在 paste 对话框里选择 As Is,点击 OK。

    3、点击 Primer,弹出菜单后点击 search 按钮。在弹出的 Search Criteria 中,选择 PCR primers,Pairs 参数,并选择所需PCR 产物长度,点击 OK。在弹出的 search progress 菜单中,点击 OK。

    4、在搜索出的结果列表里选择 Rating 值高,bug 较少的引物#1,在 Primer Premier 中选择 S(正义链)/A(反义链),点击 edit primer,将所得引物改成为 Rating 值为 100,无 bug 的引物,即无发夹(Hairpin)、无二聚体(Dimer)、无错配(False Priming)和交叉配对(Cross Dimer)的引物。点击 Accept and Quit 命令即可。

    5、点击菜单栏中 Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer,即可得到设计的引物。

    6、接下来,就要用 Oligo 软件验证评估 Premier5 软件所设计的引物,单击菜单栏里 File∣New Sequence 可打开以下窗口,并将设计好的上游引物黏贴在空白框里。

    7、点击菜单栏里 Accept/Discard 中的 Accept,则会出现 Tm、△G 和 Frq 三个窗口, △G 值反应了序列与模板的结合强度,最好引物的△G 值在 5’端和中间值比较高,而在 3’端相对较低。

    8、点击菜单栏里的 Select 中的 Upper Primer 将当前引物设置为上游引物。同时点击菜单栏里的 Edit 中的“Lower Primer"命令,在 Edit Lower 窗口中输入下游引物的序列。点击 Accept and Quit 命令即可。

    9、最后,在菜单栏中 Analyze 完成引物△G 值、Tm 值、引物二聚体和发夹结构的分析后,可将引物序列送至公司进行合成即可。


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