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    RT-PCR的无扩增产物

    发布时间: 2023-06-30  点击次数: 509次

    可能原因 1:引物问题(包括:引物设计较差,引物合成较差,引物浓度太低)。

    解决方法:设计引物的时候,避免在引物 3'端含有互补序列;避免可以形成内部发卡结构的序列;设计 Tm 类似的引物。针对引物合成的问题,用普通电泳法,看引物的设计和合成质量,是否有目的条带出现。最佳引物浓度介于 0.1μM 到 0.5μM 之间。

    可能原因 2:探针问题。

    解决办法:就要用到我们前面提到的序列分析了。用 blast 对探针序列进行比对,设计符合要求的探针。

    可能原因 3:模板问题(包括:模板质量不好,模板浓度太低)。

    解决方法:提高模板质量。如果怀疑模板被 DMSO 等抑制剂污染了,坚决采用乙醇沉淀;使用 104copy 的靶序列,然后在 25 到 30 个循环中获得信号。

    可能原因 4:不明物干扰。

    解决办法:做 RT-PCR 必须非常小心翼翼。对 RT-PCR 的任何实验样品或试剂,均应采用“三无"离心管(即无菌无酶无热源)进行试剂的分装和使用。

    可能原因 5:扩增酶问题。

    解决办法:不要省钱。买好的扩增酶。分子生物学永远是一分价钱一分货。推荐:选择hot start Taq 酶进行扩增,可提高灵敏度,增加产量,降低干扰因素。



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