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    消灭 PCR 非特异性扩增的方法

    发布时间: 2023-06-28  点击次数: 910次
    非特异性扩增,即进行 PCR 所扩增出来的条带不是所要的,引物与模板在非目的条带处有错配,导致延伸产物不是目的条带。例如引物二聚体,即引物在退火过程中产生了 hairpin 结构或其他二级结构,或者引物在模板的某些位置非特异性地结合,也同样会产生非特异性扩增。PCR 产物都是通过引物延伸产生的。当引物产生了二聚体或者非特异性扩增产物之后,引物本身就无法再延伸形成 PCR 产物了,这样的情况下,非特异性扩增产物越是多,那目的产物就越是少。如果在 qPCR 过程中,就会在熔解曲线中形成双峰。

    消灭 PCR 非特异性扩增的方法:
    1、引物设计的过程中要用 Primer premier 5.0 来验证一下二聚体;
     
    2、 引物合成后,先做一次梯度 PCR,检测最合适的退火温度,一般高退火温度可以提高引 物对模板的特异性从而降低引物二聚体;
     
    3、 降低 Mg2+浓度,镁离子浓度高,会导致大量的非特异性扩增,但是没有镁离子的话,也会导致 Taq 酶的失活;
     
    4、降低 dNTP 浓度,dNTP 也是非特异性扩增的一个罪魁祸首,降低它的浓度,也能有效降低二聚体及其他非特异性扩增;
     
    5、降低引物浓度,一般的 PCR 引物都是过量的,降低了引物浓度自然也能降低引物之间形成二级结构的可能性;
     
    6、提高退火温度,这个道理很简单,引物的退火温度提高,引物间的二级结构形成可能性就会降低;
     
    7、延长退火时间,这个也可以减弱引物间结合的可能性;
     
    8、DMSO 及甜菜碱,这些 PCR 促进剂,主要是用于 CG 含量高的模板上,降低 DNA 的二级结构的产生,但根据经验,加入 DMSO 之后需要同时提高一点退火温度来补平(qPCR 不太适用);
     
    9、热启动法,通过 95℃的高温热启动,高温解链,使得引物间的二级结构破坏,以此降低二聚体产生。


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