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    DNA复制的艺术:PCR技术的演变史

    发布时间: 2024-03-01  点击次数: 165次

    按照PCR技术的演进,我们可以将PCR技术大致划分为三代:传统PCR技术,实时荧光定量PCR技术和数字PCR技术。

    第一代:传统PCR技术

    聚合酶链式反应(PCR)的基本原理是利用DNA聚合酶在特定条件下复制特定DNA片段,通过反复的循环,这个特定的DNA片段可以被大量复制或放大。PCR过程主要包括以下三个步骤:

    • 变性(Denaturation)在高温(通常为94-96°C)下,DNA双链被分离成两条单链。这是因为DNA双链之间的氢键在高温下会断裂。

    • 退火(Annealing)降低温度(通常在50-65°C),使得人工合成的、与目标DNA序列互补的短DNA片段(即引物)能够与分离后的DNA单链结合。

    • 延伸(Extension)高温度(通常为72°C),DNA聚合酶开始在引物的末端添加相应的核苷酸,以此按照DNA的互补配对原则复制DNA。

    这种“变性—退火—延伸"就是一个PCR循环,每个循环都会使目标 DNA 序列的数量翻倍。使得DNA片段在短时间内能以2n倍进行扩增,这样就可以生成数百万到数十亿份的目标 DNA 序列。PCR的反应流程大致如下:

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    传统的PCR技术通常试管内进行,这个过程通常被反复进行30-40次,每次循环都会使目标DNA序列的数量翻倍。这样,即使开始时只有极少量的目标DNA,也可以在几个小时内得到足够数量的DNA片段。并且需要人工改变每个循环的温度变化,过程耗时且容易出错。

    然而,传统的PCR技术也有一些局限性。例如,它不能提供关于目标DNA数量的实时信息,也不能进行精确的定量分析。

    第二代:实时荧光定量PCR技术(qPCR)
    传统的PCR技术主要用于定性检测,即判断目标DNA序列是否存在。但在许多研究和应用中,人们需要知道目标DNA的具体数量,例如在基因表达分析、病原体检测、基因编辑效率评估等场景。因此传统的PCR技术通常需要在反应结束后通过电泳或其他方法来检测和分析结果,这大大增加了实验的复杂性和时间。为了解决这一问题,实时荧光PCR问世了。实时荧光PCR是一种革新性的DNA定量技术,其基本原理与传统的PCR相同,都是通过热循环引发DNA的去链和复制。然而,实时荧光PCR的特别之处在于,在PCR过程中,反应体系中添加了能够发射荧光信号的荧光标记物,使得PCR的扩增过程能够被实时监测。

    新一代的荧光标记物如SYBR Green,其与双链DNA(dsDNA)的结合能力远超过溴化乙二胺,能产生强烈的荧光信号。这种特性不仅提升了PCR检测的灵敏度,而且有助于缩短PCR实验的总体周期。在PCR过程中,每当DNA分子被复制一次,SYBR Green就会与新产生的DNA分子结合,发射出荧光信号。因此,荧光信号的强度就可以直接反映出当前扩增的DNA数量。

    但SYBR Green又有新的问题,那就是无法区分不同的DNA序列。针对需要高特异性检测的场合,研究者们开发了一系列与特定DNA序列结合的荧光探针,如双标记探针(TaqMan探针)、分子信标、Scorpions探针和LightCycler探针等。这些探针的设计原理是,一端连接荧光染料(reporter),另一端连接猝灭剂(quencher)。在PCR反应中,这些探针会与目标DNA序列特异性结合,由于荧光染料和猝灭剂距离近,荧光会被猝灭。然而,当DNA聚合酶在延伸新的DNA链时,它会分解探针,使荧光染料与猝灭剂之间的距离增大,从而产生荧光信号。

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    第三代:数字荧光PCR

    数字PCR(DigitalPCR,dPCR)的发展源于对更准确、更灵敏的分子检测方法的需求。虽然实时定量PCR(qPCR)已经广泛应用于基因表达分析、病原体检测等领域,但是它存在一些局限性,比如需要标准曲线进行定量,对样本纯度和PCR效率有较高的要求,而且对于罕见突变和低丰度目标分子的检测灵敏度不够。

    数字PCR(dPCR)是一种新型PCR技术,它通过将样品稀释并分配到数百到数百万个微小的反应室中,每个反应室中包含零个或一个模板拷贝。然后在每个反应室中独立进行PCR反应,并通过检测每个反应室的荧光信号来确定是否存在目标分子。这种方法可以直接计算出样品中的目标分子数量,而不需要像qPCR那样依赖标准曲线。

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    数字PCR是一种精确且敏感的分子生物学技术,专门用于测量DNA或RNA的数量。其主要优势在于具有高精度和高灵敏度,能够直接计算样品中的目标分子数量,并对低丰度的目标分子进行高效检测。并且数字PCR不需要依赖标准曲线或参照基因,这减少了实验偏差,使其能够在复杂样本中准确地进行定量。但数字PCR也有缺点,其中包括实验操作的复杂性、设备成本高昂,以及相对较低的样本处理能力。

    小结

    聚合酶链式反应(PCR)技术自1983年发明以来,已逐渐成为生命科学研究和临床分子诊断领域的核心技术。PCR技术的发展历程经历了传统PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)以及数字PCR(dPCR)三个重要阶段,每个阶段的技术突破和优化都为DNA的检测和分析提供了更准确、更灵敏和更高效的解决方案。

    PCR技术的发展和应用不仅深刻地改变了生命科学研究的面貌,而且在临床诊断、环境和食品安全监测、药物发现以及药物疗效监测等领域都发挥着至关重要的作用。然而,尽管PCR技术已经取得了显著的成就,但在提升PCR技术的灵敏度、准确性和稳定性,以及降低PCR实验的复杂性和成本等方面,我们仍面临着一些挑战。为了应对这些挑战,科学家们正在进行大量的研究工作,并已经取得了一些重要的突破。我们有理由相信,随着科技的进步,PCR技术将在未来的生命科学研究和临床应用中发挥更大的作用,为人类社会带来更多可能性和福祉。

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