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    什么是基因编辑技术?

    发布时间: 2024-03-22  点击次数: 301次

    一、前言

    每一个生命个体都是由无数精妙的生物分子共同组成的。而其中的DNA就像是生命的蓝图,DNA中的每一段特定序列,即我们所称的基因,各自承担着特定的生物学功能。它们共同调控着生物体的生长、发育、繁殖等一系列复杂的生命过程。然而,并非所有基因都是十全十美的,有时候,基因中的一点小小改变,就可能导致疾病的发生。但如果我们能够像编辑文字一样编辑这些基因,那我们就有可能修复这些错误,治疗疾病,甚至创造出新的生命形式。这个想法并非遥不可及。在21世纪的今天,一种名为"基因编辑"的技术正在逐渐实现这个梦想,它正在深刻地改变我们对生命的理解和认知。


    自1970年以来,基因工程已经成为一种在生物体中引入新遗传成分的主要手段。但这项技术有一个显著缺点:DNA的插入是随机的,不能精确地将基因定位到生物基因组内的特定位点。这种随机性可能会损害或改变宿主基因组中的其他基因。


    为了解决这个问题,科学家们开始研发一些列的基因编辑技术。这些技术不仅能在基因组中插入新的基因,还能精确地将这些基因定位到特定的位置,避免对其他基因的无意干扰。基因编辑技术的出现,使得我们能够从“粗糙"的基因操作,转变为“精细"的基因操作。这一系列突破性的研究不仅提高了基因操作的准确性,也为我们解决遗传疾病和开发新的生物技术提供了更多可能性。


    二、基因编辑的原理

    基因编辑的原理通常涉及到一种被称为"分子剪刀"(如CRISPR-Cas9,ZFNs或TALENs等)的工具,它可以在DNA链的特定位置将其切断。这个位置是由一段引导RNA(gRNA)确定的,它能够与目标DNA序列精确配对。一旦DNA被切断,细胞的自我修复机制就会启动,试图修复这个断裂。


    当DNA双链断裂(DSBs)发生时,细胞会启动一系列复杂的自我修复机制,试图修复这个断裂。这个位置是由一段引导RNA(gRNA)确定的,它能够与目标DNA序列精确配对。一旦DNA被切断,细胞的自我修复机制就会启动,试图修复这个断裂。


    当DNA双链断裂(DSBs)发生时,细胞会启动一系列复杂的自我修复机制,试图修复这个断裂。这些机制包括同源重组修复(HR)、非同源末端连接(NHEJ)、选择性末端连接(a-EJ)和单链退火修复(SSA)。


    • 同源重组修复(HR)同源重组修复(HR)是一种精确的DNA修复机制,但它需要一个同源的DNA模板来指导修复过程。同源模板通常来自于同源染色体或者姐妹染色单体。在基因编辑中,我们可以为人提供一个包含我们希望插入或替换的DNA序列的同源模板。通过精确控制模板的序列,我们就可以实现精确的基因编辑。但需要注意的是,HR机制主要发生在细胞的S期和G2期,因为这两个阶段细胞具有可供参考的姐妹染色单体。因此,在使用HR机制进行基因编辑时,我们通常需要考虑到细胞周期的影响。


    • 非同源末端连接(NHEJ)非同源末端连接(NHEJ)可以将断裂的两个DNA末端直接连接起来,而不需要同源性模板。这种机制的优点是可以在任何阶段的细胞周期中进行,而不受细胞分裂阶段的限制。NHEJ的缺点是它不是一个精确的修复机制。在末端连接的过程中,可能会丢失或插入一些核苷酸,导致基因序列的改变。这种改变可能会导致基因的功能丧失或改变,所以NHEJ常常在无法提供同源模板的情况下被用于实现基因的突变和敲除。


    • 选择性末端连接(a-EJ)和单链退火修复(SSA)这是两种辅助性的DNA修复机制,它们在特定的条件下被激活。a-EJ是一种不依赖于DNA-PKcs的末端连接机制,通常在非同源末端连接(NHEJ)不能正常工作时被激活。单链退火修复(SSA)则是一种依赖于大量的末端单链切除的修复机制。在SSA过程中,两个断裂的DNA末端会被切除成单链,然后这两个单链会寻找并退火到相同的序列,最后通过切除和连接的方式修复断裂。这两种修复机制都需要对断裂的DNA末端进行大量的切除,以形成单链DNA,这可能会导致一些遗传信息的丢失。因此,它们都不是精确的修复机制。但在基因编辑中,我们可以巧妙地利用这些机制来实现特定基因的突变和敲除。


    而在DNA的自我修复过程中,科学家可以利用一种被称为"修复模板"的DNA片段来引导修复过程。这个修复模板包含了科学家想要插入、删除或更改的DNA序列。当细胞的修复机制被激活时,它就会使用这个修复模板来修复DNA断裂。

    三、锌指核酸酶技术(ZFN)

    指核酸酶(ZFN)技术的发展始于20世纪80年代。当时的科学家在非洲爪蟾的调节因子中发现了锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)。这种蛋白能够识别并结合到特定的DNA序列。后来,科学家发现通过改造这些蛋白可以将其与FokI酶结合,产生成为一个能够在特定DNA序列处切割DNA的工具,前者负责识别,后者负责切割DNA。这就是锌指核酸酶。

    1、ZFN技术的原理

    ZFN由两部分组成:锌指蛋白(ZFP)和FokI内切酶。ZFP是一种DNA结合蛋白,它可以识别并结合到特定的DNA序列。FokI内切酶是一种核酸酶,它可以切割DNA。这两部分结合在一起,形成了一种可以在特定位置切割DNA的工具。

    • 锌指蛋白(ZFP)锌指蛋白由一个或多个锌指模块组成,每个模块可以识别并结合到DNA序列上的3个碱基。通过改变锌指模块的数量和类型,可以改变ZFN的识别特异性。例如,如果一个ZFN包含6个锌指模块,那么它可以识别18个碱基的DNA序列。这就使得ZFN能够非常精确地定位到基因组中的特定位置。
    • FokI内切酶FokI内切酶是ZFN的切割部分。它是一种核酸酶,可以在DNA双链上产生切口。然而,FokI内切酶只有在形成二聚体的情况下才能工作。这也就意味着需要两个ZFN分子在相邻的DNA序列上结合,才能形成一个有效的FokI内切酶二聚体,从而切割DNA。
    • DNA切割和修复当ZFN在特定的DNA序列上产生切口后,细胞的DNA修复机制就会启动。这通常会通过两种途径进行:非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)。NHEJ是一种错误修复机制,它会在DNA切口处随机添加或删除碱基,从而导致基因突变。HR则是一种精确的修复机制,它需要一个与切口处的DNA序列相匹配的模板,接着按照这个模板精确地修复切口。通过提供一个含有所需变更的DNA模板,科学家们就可以利用HR机制来进行精确的基因编辑。

    图片


    锌指核酸酶图

    2、ZFN技术的应用

    自2001年以来,ZFN已经被广泛应用于各种生物物种的基因编辑。这包括细菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物,甚至包括人类细胞。ZFN技术的一个主要应用是基因敲除,这是通过切割目标基因的DNA序列,然后让细胞的DNA修复机制产生错误,从而使基因失去功能。ZFN也可以用于基因插入,这是通过在目标DNA序列上创建一个切口,然后插入一个新的DNA片段。此外,ZFN还可以用于基因修复,这是通过切割错误的基因序列,然后引导细胞的DNA修复机制使用一个正确的模板来修复错误。

    3、ZFN技术的优点和挑战

    ZFN的主要优点是其高度的特异性和灵活性。它可以设计成识别并切割几乎任何DNA序列。然而,设计和构建ZFN是一个复杂的过程,需要大量的时间和资源。ZFN也有可能在非目标位置切割DNA,这可能导致不期望的突变。尽管有这些挑战,ZFN仍然是一种强大的基因编辑工具,已经在许多研究和临床试验中显示出巨大的潜力。

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