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    GC-1 spg细胞的培养流程及注意事项

    发布时间: 2024-03-25  点击次数: 396次

    一、介绍

    小鼠精原细胞(GC-1 spg)为贴壁细胞,细胞形态呈上皮细胞样。

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    二、主要耗材、仪器及试剂

    15ml离心管、50ml离心管、冻存管、巴氏滴管、培养瓶、封口膜、CO2培养箱、离心机、显微镜、生物安全柜、DMEM、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、青-链霉素(双抗)、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)等等。

    三、培养流程

    1. 细胞复苏

    1)擦拭生物安全柜台面,准备好所需耗材,紫外30min,打开37℃恒温水浴箱预热所用试剂;

    2)按照DMEM+10% FBS+1% P/S的比例配制血清培养基,吹打混匀后按10倍细胞的体积分装至15ml离心管中;

    3)从液氮中取出GC-1 spg细胞,在水浴箱中快速晃动使其融化;

    4)将细胞悬液转移至提前分装有血清培养基的离心管中,吹打混匀;

    5)1200rpm,离心3min;

    6)弃去废液,向离心管中重新加入新的培养基,重悬GC-1 spg细胞沉淀,并转移至培养瓶中进行培养。

    2. 细胞传代

    1)细胞密度超过80%即可进行传代,拿出细胞,弃去旧培养液;

    2)用PBS冲洗细胞2-3次(动作要轻柔,清洗时可摇晃培养瓶以保证清洗效果);

    3)弃去废液,向培养瓶中加入事先预热好的胰蛋白酶(用量要足以覆盖细胞层),轻轻晃动培养瓶以利于消化;

    4)1min左右后在显微镜下观察细胞,当90%细胞被消化下来时,向培养瓶中加入2-3ml的血清培养基,终止消化;

    5)收集细胞悬液至15ml离心管中,1200rpm,离心3min;

    6)等待离心过程中,可提前在新的培养瓶中加好完培(如T25培养瓶可先加4ml完培);

    7)弃去废液,用2ml的完培重悬细胞后分装至新的培养瓶中;

    8)盖上培养瓶盖子,以划“十字"的方式晃动培养瓶,以使细胞分布均匀,置于37℃,5%-10%CO2培养箱中进行培养。

    3. 细胞冻存

    1)从培养箱中取出培养瓶,弃去旧的培养液,用PBS清洗2-3次;

    2)加入预热的胰蛋白酶消化细胞,镜下观察消化后加入2-3ml完培终止消化;

    3)收集细胞悬液至15ml离心管中,1200rpm,离心3min;

    4)等待离心过程中,按照55% DMEM+40%FBS+5%DMSO的比例配制冻存液;

    5)离心结束后,弃去上清,向离心管中加入冻存液,重悬细胞,分装至冻存管中;

    6)将冻存管放入程序降温盒中(“慢冻"),置于-80℃冰箱中,第二天即可拿出细胞置于液氮罐中保存。

    四、注意事项

    1.培养细胞所用的培养基及血清等试剂最好沿用之前的,切忌频繁更换;

    2.弃去旧的培养液时最好不要直接倒掉,以免瓶口有残留造成污染;

    3.用胰酶消化细胞时,可轻轻晃动培养瓶,并在显微镜下观察,细胞间隙变大,轻晃培养瓶细胞可自然流下时即可终止消化,切忌剧烈拍打培养瓶;

    4.对于难消化的细胞可以分两次进行消化,以防胰酶消化时间过长对细胞造成损伤;

    5.一定要分清细胞培养瓶的正反面。

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