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    ELISA实验经验总结

    发布时间: 2024-04-18  点击次数: 242次

    前置知识

    ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,酶联免疫吸附试验)是一种常用的实验技术,用于检测和定量分析样品中特定抗原或抗体的存在。ELISA是基于免疫学原理的一种高灵敏度和高特异性的实验方法。


    ELISA实验通常包括以下步骤:


    1.涂覆:将待检测的抗原或抗体溶液加入到微孔板(通常是96孔板)中,并在孔板表面上形成一层

    固定的抗原或抗体。这个过程被称为涂覆。


    2.阻断:为了防止非特异性结合,需要在涂覆后加入一种阻断剂,例如牛血清蛋白(BSA)或牛奶粉,以覆盖孔板上未被固定的表面。阻断剂可以减少非特异性结合和降低背景信号。


    3.样品加入:将待测样品加入到微孔板中,样品中的目标抗原或抗体与固定在孔板上的抗体或抗原相互作用。


    4. 洗涤:通过反复洗涤孔板,去除未结合的物质,以减少背景信号


    5. 探针加入:加入与待测物体特异性结合的酶标记二抗(例如辣根过氧化物酶-HRP)或酶标记抗原,使其与样品中的目标物体结合。


    6. 洗涤:再次洗涤孔板,去除未结合的酶标记物。


    7. 底物加入:加入一种底物,其与酶标记物相互作用,产生可测量的信号。常用的底物是一种可被酶催化产生颜色或荧光的物质。


    8. 反应停止:通过加入一种停止剂,停止底物的反应,阻止信号进一步增加。


    9. 信号测量:使用光谱仪或荧光测量仪测量底物反应产生的信号,根据信号的强度来确定样品中目标物体的浓度。


    ELISA是分子生物学、免疫学和细胞生物学研究中常用到的实验操作之一,相信大家常常会有这样那样的实验问题。


    以下是同学汇总关于ELISA实验出现空白背景高的常见原因和处理方法的经验心得

    ELISA实验经验总结

    问题:ELISA空白背景高的常见原因和处理方法

    通常阴性孔吸光光度值不会超过0.1。

    常见原因有以下这些:

    1)洗板不干净

    解决方法:

    ①充分洗涤:如果洗板的时间不够,会导致抗体残留,阴性对照会显色,尝试延长洗板时间,增加洗板频率,在洗液中添加表面活性剂Tween-20。

    在洗板时要保证每步都全部洗涤,充分拍板直至孔内没有明显的残留液体。

    ②避免交叉污染:弃去洗液和孵育的抗体时避免交叉污染,移液枪头尽可能一次性使用,拍板的滤纸不要反复使用。

    2)显色液变质或者试剂过期

    解决方法:检查试剂盒有效期,或使用新的试剂盒并按照说明书要求保存试剂盒。每次用剩下的显色液最好不要回收,或者只回收洗净的容器装的显色液。

    3)试剂稀释有误,检测抗体/酶结合物工作液浓度过高

    解决方法:按照说明书推荐的稀释倍数稀释抗体。

    4)试剂盒组分未平衡

    解决方法:试剂盒每个组分都需要平衡至室温后进行实验。

    5)混用其他试剂盒试剂

    解决方法:保证使用试剂盒内完整的一套试剂进行实验,不同品牌及不同批次间的试剂可能存在不匹配现象,不同批号的试剂不要混用。

    6)蒸馏水受酶等污染

    解决方法:使用新鲜蒸馏水。

    7)培养箱温度超过37℃或反应时间过长

    解决方法:孵育时间过长、温度过高可能会导致非特异性结合增加,从而造成本底增高。检查恒温箱,确保孵育温度稳定在37℃,按照说明书的反应时间进行孵育。

    8)酶标板底部有污渍

    解决方法:在加完终止液之后,检测之前,用75%乙醇浸润的脱脂棉球擦拭酶标板底部,确认没有污渍之后再检测。

    9)洗液被污染

    解决方法:洗液现配现用,长期放置会析出,也可能会污染,导致背景偏高。

    10)包被的抗原被污染

    解决办法:仔细回想操作过程,换新的抗原包被。

    11)封闭液、封闭时间、封闭液的浓度

    解决办法:封闭液(BSA)可能会与抗体产生交叉反应。封闭液的浓度偏低、封闭时间过短导致部分封闭,抗体与酶标板结合,可能也会导致背景偏高,因此可以适当调整封闭液的浓度和时间以降低背景。

    12)抗体质量差或选择的抗体不合适

    解决办法:抗体质量不高,特异性不好可能会与封闭液(BSA)产生交叉反应,可以用0.8%明胶(明胶不含有血清成分)代替。

    若选择多克隆抗体孵育,可能会与酶标单抗产生交叉反应,导致背景增加,最好选用与酶标单抗同种属的多克隆抗体。

    13)酶标仪设置参数有误

    解决办法:检查酶标仪设置的波长,不同波长下样品的吸光光度值也会有很大的差别,按照说明书要求设置参数。

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