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    要做好CCK-8实验,这三个重要环节请注意

    发布时间: 2024-04-17  点击次数: 179次

    在做细胞基础实验时,必要的一步就是需要探究清楚细胞的增殖变化和毒性耐药变化情况,为下一步实验做准备。


    我们在做CCK-8增殖和毒性实验中常常会遇到一下几个问题:

    1.细胞铺板问题 2.给CCK-8的方式问题 3.CCK-8的反应时间问题


    首先,在进行细胞铺板时, 需要用血球计数板进行细胞计数,得到细胞数量后按照所需铺板的细胞数量进行调整。一般96孔板铺板数量为1*10^6/孔。


    制备细胞悬液时需要反复吹打,使细胞悬液充分混匀,降低出现细胞团块的几率。一般96孔板,每孔加入100微升细胞悬液,从孔的9点钟方向打入,加入半张板子时,需要再次将细胞吹匀,然后继续加剩余的孔。


    待全部加入完毕时,盖上盖子,放入培养箱。(细胞的均匀铺被是本实验成功的大前提)。


    其次,是细胞的处理。一般给CCK-8有两种方式:第一种是直接每孔加入10微升的CCK8原液;另一种则是配置含10%的CCK-8培养基,以换液的形式加入孔板。


    第一种方式的弊端在于10微升的CCK-8量比较少,可能因沾在孔壁导致误差的出现。


    第二种方式可以避免上述情况的发生,但操作过程中仍需注意10%的CCK-8培养基需要现配现用;其次打入100微升的CCK-8时沿着孔壁将枪头伸入液体缓缓打出,再移出枪头。


    期间可能会产生小气泡,需要用无菌针头烧红插入气泡,消除气泡。(气泡会影响OD值,因此应该尽量消除)。


    最后,就是反应时间问题。将孔板放入培养箱培养1-4小时,引细胞种类和数量的差异,可能形成的Formazan的量不一样。因此需要把握好培养的时间。


    我的经验是:在培养2h后,取出孔板,每孔抽取90微升加入至新孔板,进行第一次检测,看看显色的深浅程度(仍然需要注意气泡,若有气泡需要待气泡消除后再进行检测)


    若显色较浅,则可除去旧培养基,加入新培养基,再培养1-4小时,重新加CCK-8步骤,然后将其放入培养箱培养4小时,再进行检测(其最佳反应时间为0.5、1、2小时)


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